【DeepSeek专栏】Nat Biotechnol | Cas13d的表达水平是影响旁切活性的关键

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CRISPR-Cas13d作为RNA靶向工具，因其高效性和特异性在基因治疗、转录组编辑等领域展现出巨大潜力。然而，其非靶向的“旁切”现象可能引发细胞毒性，阻碍临床应用。尽管早期研究在病毒递送系统中未检测到显著的旁切活性，但近期高剂量转染实验表明，Cas13d的高表达可能导致全局RNA降解。

近日，纽约大学Neville E. Sanjana团队在Nature Biotechnology上发表了文章Precise RNA targeting with CRISPR–Cas13d。 本研究系统探究了Cas13d表达水平与旁切活性的关系，并提出了优化策略。

研究团队首先通过构建可诱导表达Cas13d-P2A-mCherry的质粒，比较了不同递送方式（转染与慢病毒转导）对Cas13d表达的影响。结果显示，转染高剂量质粒（250-500 ng）时，mCherry荧光强度是病毒转导的2.4-4.4倍，且细胞群体内表达异质性显著增加。进一步靶向高表达基因MIF和B2M发现，高剂量转染导致EGFP报告基因及内源性转录本（如ACTB、FTH1）的RNA和蛋白水平显著下降，而低剂量转染或病毒转导未引发附带降解，且细胞活性未受明显影响。这表明Cas13d的表达水平是调控旁切活性的关键因素。

为验证这一结论，研究设计了合成致死基因对HDAC1/HDAC2的配对靶向实验。通过引入错配gRNA梯度降低靶向效率，发现仅在高剂量转染条件下，单独靶向HDAC1即可引发细胞存活率下降及EGFP信号减弱，而病毒递送系统仅在双基因靶向时触发表型。这进一步支持Cas13d的高表达通过增强靶向结合力间接激活旁切活性。

研究还评估了高保真Cas13d变体（hfCas13d）的性能。与野生型相比，hfCas13d的靶向结合效率降低3-13倍，导致其在转录组规模筛选中对必需基因的敲低效果显著减弱（仅5%基因有效，而野生型为96%）。尽管hfCas13d旁切活性降低，但其低效的靶向作用限制了功能性筛选的实用性，提示需在安全性与效率间权衡。

综上，本研究揭示了Cas13d的旁切活性与其表达水平密切相关，通过低拷贝病毒递送可有效平衡靶向效率与安全性，而高保真变体的应用需进一步优化。这一发现为CRISPR-Cas13d的临床转化提供了重要指导：在基因治疗中，需精细调控递送剂量以避免毒性；在功能性筛选中，野生型Cas13d的低剂量递送仍是首选策略。未来研究可结合人工智能优化gRNA设计或开发新型变体，以实现更高精准度的RNA编辑，推动该技术在疾病治疗和基础研究中的广泛应用。

https://www.nature.com/articles/s41587-025-02558-3

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