【DeepSeek专栏】Nat Methods | 新型糖结合荧光探针Rhobo6实现细胞外基质实时动态成像

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细胞外基质（ECM）是生物体内由糖蛋白、蛋白聚糖等多糖和蛋白质构成的复杂网络，在细胞间信号传递、组织机械性能调控、发育和疾病 （如肿瘤转移） 中发挥关键作用。然而，ECM的实时成像长期面临挑战：传统方法如抗体标记受限于大分子扩散性差，基因标记操作复杂且可能干扰细胞功能，而无标记技术 （如二次谐波成像） 仅能检测特定成分 （如胶原纤维） ，此外，ECM成分异质性强，因此需要一种能全面捕捉其动态结构的通用工具。

针对这一难题，2025年2月6日，美国Janelia Research Campus的Kayvon Pedram团队在Nature Methods上发表了文章Live imaging of the extracellular matrix with a glycan-binding fluorophore。研究团队开发了一种新型小分子荧光探针Rhobo6，通过结合ECM中广泛存在的糖链，实现了活体组织内ECM的实时、无侵入性成像。

Rhobo6的设计基于硼酸与糖链中1,2-或1,3-二醇的可逆结合特性。研究团队在罗丹明荧光团中引入两个邻氨基甲基苯硼酸基团，增强了对糖链的结合能力，并通过添加羧酸基团使其具备细胞膜不可渗透性，避免胞内累积干扰信号。光物理特性分析表明，Rhobo6在结合糖链后荧光强度增强且发射光谱红移 （吸收峰从523 nm移至536 nm，发射峰从546 nm移至560 nm） ，这一特性使其兼容常规红色荧光成像参数 （如561 nm激发） 。此外，Rhobo6的低亲和力 （表观Kd约53 μM） 确保其结合可逆，游离探针可不断补充光漂白分子，从而在长达9小时的连续成像中保持信号稳定。

研究团队通过多层面实验验证Rhobo6的实用性。在体外，Rhobo6可标记胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白等多种ECM成分，且信号依赖于糖链完整性 （经高碘酸或软骨素酶处理后信号减弱） 。在细胞层面，Rhobo6成功标记过表达黏蛋白MUC1ΔCT的细胞表面糖萼，且酶解黏蛋白后信号消失，证明其糖链特异性。活体组织实验中，Rhobo6通过局部浸泡或全身注射在小鼠唾液腺、胰腺、肌肉等器官中清晰显示ECM结构，且对胚胎腺体发育无毒性。值得注意的是，Rhobo6在斑马鱼伤口修复中动态捕捉ECM重塑，在果蝇脑组织中标记神经元周围基质，甚至在拟南芥根部显示细胞表面糖链分布，展现出跨物种适用性。

在肿瘤研究中，Rhobo6揭示了乳腺癌模型的关键特征，将表达膜锚定荧光蛋白的4T1细胞嵌入胶原基质后，Rhobo6实时显示侵袭前沿胶原纤维的定向排列 （与细胞突起平行） ，而静态区域纤维呈无序分布，这与肿瘤侵袭的力学模型一致。此外，在MMTV-PyMT转基因小鼠模型中，Rhobo6活体成像清晰区分正常乳腺导管周围基质与癌变区域的致密基底膜及纤维网络，为肿瘤微环境研究提供新视角。

该研究首次将硼酸-糖链化学特性与荧光探针设计结合，突破了ECM实时成像的技术瓶颈。Rhobo6的优势体现在四个方面：其一，无需洗涤或遗传操作，简化实验流程；其二，低亲和力可逆结合减少对天然结构的扰动；其三，广泛识别糖链的特性提供ECM全局视图；其四，优异的光稳定性和组织穿透性支持长时间活体观测。未来，通过优化探针选择性 （如区分特定糖链类型） 或开发近红外变体，Rhobo6有望在临床活检、术中导航等领域拓展应用。这项技术不仅为发育生物学、肿瘤学等基础研究提供新工具，也为基于ECM动态变化的疾病诊断开辟了新可能。

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02590-2

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