《食品科学》：河北农业大孙纪录教授等：红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白制备抗酪氨酸酶活性肽及其活性表征

河鲀因其味道鲜美和营养价值丰富而成为重要的食物资源。河鲀因其独特的生物活性和加工特性在化妆品、功能食品以及医药等行业均具有应用潜力。 红鳍东方鲀（ Takifugu rubripes ）是养殖河鲀最常见的种类之一。 在生产加工中红鳍东方鲀鱼皮（占其个体总质量的16%，粗蛋白含量高达24.80%，胶原蛋白占比80%）因不能得到充分的利用而被丢弃。 通过生物或化学降解等途径将胶原蛋白转化为生物适应性强、利用率高的生物活性小分子（胶原水解物和多肽）是当前利用胶原蛋白的有效途径。

鱼皮胶原蛋白肽具有较强的抗衰老活性（含有抗酪氨酸酶和清除自由基能力）。酪氨酸酶通过氧化作用加速酪氨酸生成黑色素，过多的黑色素沉积易引发老年斑、雀斑、恶性黑色素瘤等皮肤衰老问题，通过酪氨酸酶抑制剂阻断酶促反应可以有效抑制黑色素生成。

河北农业大学食品科技学院的李晓雅、郭明珠、孙纪录*采用响应面法和多肽筛选方法优化具有抗酪氨酸酶活性的红鳍东方鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白肽制备工艺，同时表征其抗酪氨酸酶活性、抗氧化作用以及体外模拟胃肠消化后活性动态变化，分析其吸湿与保水性能，旨在为红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白肽在抗衰老中的广泛应用提供参考。

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红鳍东方鲀鱼皮抗酪氨酸酶活性肽的制备

1.1 适宜蛋白酶种类的筛选

蛋白质水解物制备过程中所用原料的氨基酸组成对水解物的生物活性有重要影响，肽的特定功能是由其组成氨基酸的性质、种类及其R基团的差异决定。可利用蛋白酶的特异性探究不同种类酶抑制左旋多巴氧化的速率评估其抗酪氨酸酶活性。不同种类的酶裂解蛋白质结构中不同位置的肽键，会形成具有不同氨基酸组成和长度的抗酪氨酸酶活性肽序列，导致其活性具有差异。根据Zeng Huajin等的研究，具有抑制氧化途径或结合酪氨酸酶活性位点（Cu2+）能力的抗氧化物质可以抑制酶的催化反应，极性或不带电的氨基酸残基（如丝氨酸和半胱氨酸）通常存在于有效的酪氨酸酶抑制剂肽中。如图1所示，中性蛋白酶（22.01%）和木瓜蛋白酶（21.95%）酶解产物的酪氨酸酶抑制活性显著高于其他蛋白酶解组，且两组之间无显著差异。中性蛋白酶组水解度（19.29%）显著高于其他蛋白酶组酶解产物，与木瓜蛋白酶相比，中性蛋白酶价格更低廉、酶解效率更高。因此选择中性蛋白酶作为抗酪氨酸酶活性肽的制备用酶。

1.2 酶解条件的单因素试验结果

如图2A所示，水解度与酶解时间呈正相关，这可能是由于在酶水解过程中，天然蛋白中的大部分肽被裂解，转化为更短或更长的肽，从而产生较多的酶解产物，使得酪氨酸酶抑制活性和水解度逐步增大，酶解8 h后水解度略有降低，可能是此时溶液达到饱和状态，体系中存在的大量肽片段或者氨基酸进攻酶-肽片段，发生蛋白质的合成反应，新生成的肽分子在结构、性质等方面显著不同。综合考量生产效率和预防过度酶解等方面，酶解时间选择8 h为宜，此时中性蛋白酶将ASC的肽链完全断开，生成了短肽或者氨基酸。

如图2B所示，适当提高底物质量浓度可以增强多肽活性与水解度。当底物质量浓度为2、3、4 g/100 mL时，酪氨酸酶抑制活性无显著差异（P＞0.05），而水解度在底物质量浓度为3 g/100 mL时达到最高，为51.39%。这是由于底物扩散而导致酶聚集，从而使反应达到饱和，酶切割速率受到抑制。因此适宜的底物质量浓度在2.5～3.5 g/100 mL之间。

如图2C所示，底物质量浓度和酶解时间不变，水解度随酶添加量增大而升高。当酶添加量低于8 000 U/g时，酶解产物的酪氨酸酶抑制活性、水解度和酶添加量呈正相关，酪氨酸酶抑制活性在酶添加量为8 000 U/g时无显著变化，而当酶添加量大于10 000 U/g时呈降低趋势。酪氨酸酶抑制活性在酶添加量为8 000 U/g时达到最大，为24.86%，因此酶添加量选择8 000 U/g为宜。

1.3 酶解条件的响应面优化

水解度是酶解过程中不同蛋白酶破坏蛋白质肽键断裂的百分比，该反应增加了生物活性肽的数量和种类。在最适条件下酶具有固定的切割位点，到达一定时间后底物被消耗完全，因此根据单因素试验结果可以确定生物活性肽的最佳水解条件，以酪氨酸酶活性抑制率为响应值进行后续响应面优化试验。采用Box-Behnken设计方案，结果见表3。使用Design-Expert V 10.0.1软件对结果进行回归拟合，得到的二次回归模型方程：Y＝32.60-0.56A-0.66B-0.56C+0.27AB+0.32AC-0.15BC-1.56A2-1.26B2-2.12C2。

由表4可知，模型具有显著性意义（P＜0.01），模型失拟误差为0.802 45＞0.05，即模型失拟项不显著。对Y进行显著性检验，模型的决定系数为R 2 ＝0.959 0＞0.95，说明实验值与预测值具有较高的相关性；变异系数＜10%，说明模型有很高的响应值信度，实验结果比较可靠。综上所述，所选参数之间存在一定的相关性，对解释观测数据中变量的影响具有较高的置信度。通过分析抗酪氨酸酶活性的模型可知：因素A、B、C的P值均小于0.05，即对酪氨酸酶活性抑制率影响显著，对酪氨酸酶活性抑制率的影响由大到小依次为底物质量浓度＞酶添加量＞酶解时间，且每两个独立因素都会对抗酪氨酸酶活性产生影响。

采用Box-Behnken回归模型得到图3。图中椭圆的稀疏、等高线的形状和坡度的陡峭程度等反映了响应值对结果的影响。由表4、图3可知，3 个因素的交互项不显著，响应面坡度较缓，等高线近似为圆形。优化后红鳍东方鲀鱼皮ASC酶解工艺参数：底物质量浓度2.86 g/100 mL、酶解时间7.78 h、酶添加量7 861.86 U/g，所得酪氨酸酶活性抑制率预测值为32.79%，为了实际操作方便，选取底物质量浓度为2.9 g/100 mL、酶解时间7.8 h、酶添加量7 862 U/g，在此条件下进行3 次重复验证性实验，得到酪氨酸酶活性抑制率为（35.14±0.03）%，预测值与实测值相差不大，说明利用响应面优化得出的最佳工艺参数可靠、有效，根据该工艺酶解红鳍东方鲀鱼皮中的ASC，所得物质具有较好的生物活性。

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红鳍东方鲀鱼皮ASC水解物中CP的分子质量分布

如图4、表5可知，酶解得到的抗酪氨酸酶活性肽分子质量多分布在5 kDa以下，特别是0.1～2 kDa分子质量之间的肽段（占比90.23%），其中分子质量小于10 kDa的胶原蛋白肽所占比例为99.98%＞90%，符合GB 31645—2018。罗春艳等酶解鱿鱼须透皮液得到的胶原蛋白肽分子质量集中在1～5 kDa之间，与之相比，本研究所得红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白CP的小分子肽含量更高。酶解产物的分子质量分布与其水解度的变化趋势相互印证，该酶解工艺水解度较高，产生较多的肽段有利于发挥其生物活性。

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ASC水解液的抗酪氨酸酶活性

蛋白肽的抗酪氨酸酶活性与其分子质量相关，利用超滤分级可实现对酪氨酸酶活性抑制肽的富集。如图5所示，酪氨酸酶活性抑制率与胶原肽质量浓度呈剂量依赖性。CP-1的抗酪氨酸酶活性最高，即IC 50 较小。在测定酪氨酸酶催化左旋多巴氧化反应的速率时，与CP的抗酪氨酸酶活性（IC50为69.89 mg/mL）相比，CP-1的IC50降低至40.50 mg/mL。肽的活性可能因材料的来源有所差异，本实验仅对酶解产物进行超滤分离，没有对活性肽进一步分离（目前企业生产也多为超滤分级产物），CP-1组分是水解液而不是纯化的肽，因此IC50较高，该结论与宋永相等的研究结果相似。氧化途径的阻断和酶活性位点的结合可能与抑制酪氨酸酶的催化反应有关，CP-1组分可以同时发挥上述两种作用，综上所述，红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白水解液的CP-1组分可作为来自天然资源的抗酪氨酸酶活性肽，是一种安全的抗黑素肽，具有进一步开发的潜力。

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抗酪氨酸酶活性肽的抗氧化活性分析

肽具有清除自由基、贡献电子和螯合金属离子的特性，胶原蛋白水解物中的电子/氢供体肽能够与自由基反应，中断自由基链反应，进而表现出较强的抗氧化活性。抗氧化剂的抗氧化机理形式多样，在评价不同物质的抗氧化活性时应采用多种自由基模型。如图6所示，CP-1对不同自由基的清除能力存在差异，但其抗氧化活性均与肽质量浓度呈正相关。CP-1对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除活性的IC50分别为9.51、2.03 mg/mL和7.29 mg/mL，其中CP-1抗氧化活性中ABTS阳离子自由基的清除活性最高，这可能是由于ABTS阳离子自由基测定法倾向于检测疏水和亲水化合物，而DPPH法适用于疏水化合物。欧阳小健利用中性蛋白酶酶解产生了抗氧化活性较强的氨基酸残基（Phe、Gly、Cys、Tyr、Trp和Arg），可作为良好的抗氧化肽制备用酶，该结论与本研究结果一致。因此，本实验筛选出的抗酪氨酸酶活性肽组分具有较强的抗氧化活性，有利于扩大其应用领域。

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红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白肽的应用性分析

5.1 抗酪氨酸酶活性肽体外模拟胃肠消化前后生物活性变化

肽可被内源性酶消化，从而失去活性，因此通过体外模拟胃肠消化评价其稳定性对实际应用具有积极意义。根据CP的分子质量分布、抗酪氨酸酶活性和抗氧化活性结果可知，CP-2含量低、生物活性不高，与CP-1相比实际应用性较差。如图7所示，CP-1经胃肠消化后的抗酪氨酸酶活性、DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力和羟自由基清除能力的IC50分别为20、5、5、5 mg/mL。胃蛋白酶和胰蛋白酶可切割不同位置的肽键产生甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸和酪氨酸等氨基酸。胃蛋白酶倾向于切割含有疏水性氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸）的肽段，胰蛋白酶作为肽链内切酶特异性地切割肽链C端的精氨酸和赖氨酸，增加酪氨酸酶的抑制活性。经胃肠消化后，CP-1的酪氨酸酶活性抑制率由23.81%提升至60.96%。此外，CP-1经过胃消化后，DPPH自由基清除活性、ABTS阳离子自由基清除活性和羟自由基清除能力显著增强，其中羟自由基清除能力极显著提高。肠消化与胃消化的影响不显著。结果表明，CP-1在体外模拟胃肠消化过程中其抗酪氨酸酶活性和抗氧化活性有所提高，这可为红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白肽在抗衰老类产品中的开发利用提供理论支持。

5.2 吸湿性和保湿性能分析

吸湿和保湿性能分析可用于评价其吸水与持水能力。从图8可以看出，随着时间的变化，CP-1和甘油的吸湿率、保湿率曲线变化相似。由图8A可知，甘油的保湿效果更好，随着时间的延长CP-1和甘油保湿率呈现相同的降低趋势，CP-1的保湿率略低于甘油。由图8B可知，CP-1和甘油均表现出较强的吸湿能力，随着时间的延长吸湿率逐渐增加，酶解使较多的亲水性基团暴露，在48 h后，CP-1的吸湿率达到了78.52%，低于甘油（98.90%）。结果表明，CP-1具有较好的吸湿性与保湿性。

结论

本研究应用中性蛋白酶对红鳍东方鲀鱼皮ASC进行酶解，利用响应面法优化的最佳酶解工艺制备抗酪氨酸酶活性肽，分析了酶解产物的分子质量分布情况，0.1～2 kDa分子质量之间肽段占比90.23%。进一步分级发现＜3 kDa的肽组分CP-1具有较高的抗酪氨酸酶活性（IC50为40.50 mg/mL）和抗氧化活性（DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除率的IC50分别为9.51、2.03、7.29 mg/mL）。CP-1经体外模拟胃肠消化后抗酪氨酸酶活性显著增强，并且具有作为天然来源美白活性物质的应用潜力。综上所述，CP-1组分可为开发肽饮品提供理论支持。新型产品与有效成分新来源的开发一直是食品、化妆品等领域发展方向，红鳍东方鲀鱼皮酸溶性胶原蛋白肽具有成本低廉、来源广泛、绿色健康、安全无毒等应用优势，是一种可替代传统原料的天然绿色资源，商品化潜力巨大，值得深度开发。

通信

作者

孙纪录 教授

河北农业大学食品科技学院，博士，教授，硕士生导师。河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队水产品深加工岗位专家。1994年于北京农业大学食品科学系获学士学位，2002年于河北农业大学食品科技学院获硕士学位，2012年于中国农业大学食品科学与营养工程学院获博士学位。自1994年7月起，一直在河北农业大学任教。主要从事水产品加工与贮藏、食品生物技术领域的研究，近年来的主要研究方向为传统发酵水产品生产工艺改良、甲壳类水产品加工废弃物的综合利用、水产品蛋白质的改性和过敏原削减。主持完成河北省自然科学基金项目1项，河北省重点研发计划项目2项。获得河北省科技进步一等奖2项：“酶工程技术及其在农产品深加工中的应用研究”（2007，排名第2），“乳酸菌优良菌种选育及直投式酸奶发酵剂研制”（2009，排名第6）。获得河北省教学成果奖1项：“深化教学改革，创建面向21世纪食品微生物学教学新模式”（2005，排名第5）。以第一作者或通信作者发表科技论文40余篇（其中SCI/EI收录20余篇）。

本文《红鳍东方鲀鱼皮胶原蛋白制备抗酪氨酸酶活性肽及其活性表征 》来源于《食品科学》2024年45卷第13期115-124，作者：李晓雅，郭明珠，刘书源，桑亚新，张海恩，孙纪录*。 DOI :10.7506/spkx1002-6630-20230919-168。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：农梦琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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