活细胞的超多重 CARS 光谱成像

图 1.(a) CARS [3] 和 (b) 多路复用 CARS的能量示意图，显示接地、虚拟和振动状态。对于多路复用 CARS，通过用宽带超连续脉冲代替窄带斯托克斯光束来获得多种振动模式。

　　概述

　　流行的分子成像技术只能揭示人体内用色素或荧光蛋白标记的特定分子的分布或行为。然而，拉曼光谱允许研究人员通过光谱分析来识别未标记分子的成分。因此，振动(拉曼)光谱通常被称为分子指纹图谱。使用这种无标记分子成像增加了发现体内意外变化和异常的可能性。

　　一种基于拉曼的创新技术，称为超多重 CARS 光谱成像，在实验和临床应用中展示了小型化、无创、实时和细胞级分子诊断的巨大实用性。这项技术能够通过在宽光谱范围内同时收集的定量光子数据来观察和分析生物结构和过程，并且正在不断改进和改进。

　　例如，日本筑波大学的 Hideaki Kano 副教授和他的同事最近对活细胞(18 种颜色对应 18 个波数)进行了超多路 CARS 光谱成像，每像素的有效曝光时间为 1.8 毫秒，这是迄今为止报道的光谱覆盖范围~3000 厘米-1.2

　　CARS 基础知识

　　相干反斯托克斯拉曼散射 (CARS) 得名于这样一个事实，即这种非线性光谱技术不是使用传统的单个激光器，而是利用一对非常强的相干激光束照射样品，从而产生反斯托克斯频率信号。虽然第一个激光器的频率通常是恒定的，但第二个激光器的频率可以调整，以使两个激光器之间的频率差等于感兴趣的拉曼活性模式的频率。这种特殊模式将是拉曼信号中唯一极强的峰。

　　CARS 比正常拉曼发射强几个数量级。执行 CARS 不一定需要光栅;如果宽带干涉滤光片后面放置了检测器，则可能会起作用。接下来介绍了 CARS 的数学和示意图描述。参见图 1a。

　　两个频率为哦1 和哦2(哦1>哦2 )相干相互作用以产生频率较高的强散射光2 小时1-哦2.如果两个激光器之间的频率差 (哦1-哦2 ) 等于频率哦m拉曼活跃的振动、旋转或其他模式，然后是频率。

　　换句话说，为了获得强拉曼信号，应以这样的方式调整第二个激光频率哦2= 哦1-哦m.那么强散射光的频率将是2 小时1-哦2= 2 小时1- (哦1-哦m) = ω1+ 哦m，它高于激励频率。

　　除了克服大多数生物分子的低信号强度外，CARS 还提供定向发射和窄光谱带宽，不受自发荧光的干扰。CARS 研究包括微生物细胞、真核细胞、捕获细胞、医学组织、上皮组织、肌肉组织、神经组织、肺组织、乳腺组织、骨骼和皮肤。

　　CARS 显微镜的快速扫描功能对于研究实时动力学的研究人员来说非常宝贵。此外，与荧光显微镜技术相反，细胞可以在 CARS 中重复成像，而不会因光漂白而出现褪色问题。

　　多路复用 CARS 和超多路复用 CARS

　　多重 CARS(见图 1b)是一种增强型 CARS 技术，它采用多通道检测器(例如，科学级 CCD 或 CMOS 相机)与光谱仪耦合，以覆盖相干拉曼信号的宽光谱范围。

　　通过使用宽带激光源(例如，超连续光源或飞秒激光源)代替可调谐激光 ω2，多路复用 CARS 信号的典型频谱覆盖范围可以进一步扩展，达到约 3000 厘米-1.这种超多重 CARS 光谱成像方法足够广泛，可以检测所有振动基本模式——包括至关重要的指纹区域(在该区域可以识别未知有机化合物并相互区分)以及 C-H 和 O-H 拉伸区域(有助于识别脂质、蛋白质和核酸的粗略分子分布)。

　　新的超多重 CARS 实验

　　2000 年春天，当 Hideaki Kano 博士作为博士生参加在旧金山举行的 CLEO 会议时，他被使用光子晶体光纤生成超连续谱所吸引，这种光纤只需要飞秒激光振荡器即可产生超连续谱 (SC)。后来，在东京大学的滨口实验室开始了他的学术生涯后，他开发了一种利用 SC 生成的国产逆拉曼光谱系统(现在通常被称为受激发拉曼损耗或 SRL)光谱系统。

　　在他的实验过程中，Kano 博士碰巧发现了 CARS 信号，它非常强烈，实际上比反向拉曼(即 SRL)信号更容易检测。他很快意识到，将 SC 生成与光谱仪相结合不仅在基础光谱学领域，而且在光谱成像刚刚兴起的生命科学领域也将是一个突破。

　　实验装置

　　Kano 博士的实验装置中集成了两个激光源，以及具有超高 NIR 灵敏度的新型高读出速度 CCD 相机和高通量光谱仪。参见图2。

　　第一个基于主振荡器光纤放大器 (MOFA) 配置的激光源涉及一个微芯片振荡器——一种包含 Nd：YVO 的无源 Q 开关激光器4晶体与可饱和吸收镜和掺镱光纤放大器键合。第二个来源是无源 Q 开关微芯片 Nd：YAG 激光器。研究人员能够根据所研究的样品类型切换激光源，从而在波长、时间持续时间、重复频率和输出平均功率方面提供良好的实验灵活性。

　　图 2.超多重光谱 CARS 系统。礼貌筑波大学 Hideaki Kano 博士;改编自 OSAContinuum， 1693-1705 (2019)。

　　与 Kano 博士和他的同事在之前对活细胞进行超多重 CARS 光谱成像研究时使用的最先进的 CCD 相机相比，新推出的科学 CCD 相机提供的 NIR 灵敏度要高得多。

　　除了在重要的 NIR 活体成像波长下具有更高的灵敏度外，这款新相机还提供了与 Kano 博士时间分辨研究中使用的超快激光器同步所需的高速操作。研究人员将相机与高通量光谱仪耦合，该光谱仪分散镜头收集的 CARS 信号以供相机检测。

　　在用于对活细胞进行成像之前，首先通过测量聚苯乙烯珠(直径：10 μm)的 CARS 信号来评估实验系统。在 600 cm 范围内检测到微珠的超多重 CARS 信号-1至 3600 厘米-1跟分辨率 <10 cm-1.像素停留时间为 ~1 毫秒，从微珠中采集了 161 × 161 个像素的 CARS 图像，总数据采集时间为 ~28 秒(图 3)。

　　图 3.苯环呼吸振动模式下的 CARS 图像 (1003 cm-1)在不同的深度位置;图像是利用被动Q 开关微芯片 Nd：YAG 激光器和 CCD 相机获得的。分辨率为161 × 161 像素，总数据采集时间为 ~28 秒，尽管使用低成本的 Microchip 激光源。2由 Tsukuba 的 Hideaki Kano 博士提供大学;首次发表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

　　活 A549 细胞的成像

　　在通过对聚苯乙烯珠子进行成像验证系统的性能后，研究人员使用高速、高灵敏度的 CCD 相机和 MOFA 激光源对活细胞 (A549) 进行了成像(图 4)。在2850 厘米-1在光谱上，以红色渲染的亮点对应于单元内的一个亮点，而该亮点又对应于中文2拉伸振动模式主要在细胞内脂滴中观察到。请注意，原始 CARS 信号由振动谐振信号和非谐振背景组成。这两个组件相互干扰并产生分散的线形。

　　图 4.(a) A549 细胞的光学图像;(b) 2850 cm 处的 CARS 强度映射-1;(c) 在 (b) 中的两个位置使用红色和蓝色叉表示的原始 CARS 信号的频谱分布。图像是使用 MOFA 激光源获得的和 CCD 相机。由筑波大学的 Hideaki Kano 博士提供;第一发表于 OSA Continuum 2，1693-1705 (2019)。

　　接下来，Kano 博士和他的同事通过进行数值分析提取纯振动共振信号，以获得自发拉曼等效光谱图。他们发现这些所得光谱图谱的主要特征分别与细胞内脂质和蛋白质的主要特征非常一致。十几个特征拉曼带之间3427 厘米-1和 1009 厘米-1对应于振动模式。

　　有关本研究的其他数据和更详细的讨论，请参阅以下文章：Hideaki Kano、Takumi Maruyama、Junko Kano、Yuki Oka、Daiki Kaneta、Tiffany Guerenne、Philippe Leproux、Vincent Couderc 和 Masayuki Noguchi，“具有 1 毫秒像素停留时间的超多路复用 CARS 光谱成像”，OSA Continuum 2,1693-1705 (2019)。

　　进展与展望

　　研究人员进行了超多重 (600 cm-1- 3600 厘米-1) 对活细胞进行 CARS 光谱成像，报告了光谱范围为 ~3000 cm 的宽带 CARS 迄今为止的最快时间-1.基于清晰的分子指纹，Kano 博士和他的同事可视化了具有超过 15 个振动带的细胞内分子分布。在软件上 1 毫秒的曝光时间相当于每个像素的有效曝光时间为 ~1.8 毫秒，与 Kano 博士之前关于活细胞成像的研究(其中每个像素的曝光时间为 50 毫秒)相比，这是一个显着的减少。这种改进主要归功于新推出的 CCD 相机更高的灵敏度和读出速度。2,7

　　这种高速技术与多变量分析方法的结合可以帮助生命科学家和医生获得对细胞内代谢活动动态的有意义的见解。Kano 博士的研究小组目前正在与一名病理学家合作，使用分子指纹开发一种新的光谱诊断工具。

　　关键技术

　　为了促进他们最近的工作，研究人员选择了Teledyne 普林斯顿仪器 BLAZE®相机采用专有的“超深耗尽型”CCD，由高电阻率块状硅制成8.该相机旨在产生任何可用硅器件中最高的近红外量子效率，采用背照式 1340 x 400 光谱阵列格式(20 μm 方形像素)，能够在空气中冷却至 -95°C，无需冷却器或液体辅助，可实现低暗电流性能。

　　BLAZE 还为研究人员提供了 CCD 相机中最快的 ADC 速度。新传感器平台的双 16 MHz 读出端口经过精心设计，可在完全垂直合并的情况下实现前所未有的超过 1600 个光谱/秒的光谱速率，在动力学模式下运行时高达 215 kHz。

　　与 BLAZE 相机配合使用的光谱仪是 Teledyne Princeton Instruments LS-785。由于其快速 f/2 光学系统和专有的 AR 涂层镜头可实现最佳近红外透射，LS-785 可以实现高达 4 倍的标准 f/4 反射光谱仪的吞吐量。CCD 相机和基于镜头的光谱仪的所有功能和定时均在实验装置中通过 Teledyne 普林斯顿仪器 LightField®64 位软件。