Nat Commun丨一伤百态，神经元的命运各不相同

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创伤性脑损伤（TBI）是神经退行性病变的一个风险因素，然而关于这种损伤如何改变神经元亚型的信息却很少。

基于此，2025年1月27日美国国立卫生研究院ClaireE.LePichon研究团队在Nature communications杂志发表研究论文“The transcriptional response of cortical neurons to concussion reveals divergent fates after injury”揭示了轻度创伤性脑损伤（mTBI，也称为脑震荡）后皮层神经元如何通过转录水平的变化来响应损伤，并且这些变化如何导致不同神经元群体有不同的结果或“命运”。

在这项研究中，在单次轻度TBI（mTBI）后随时间跟踪神经元群体，以评估损伤在单一、转录定义的神经元类别水平上的长期后果。通过使用与ATF3相连的诱导型报告基因，标记了这些受损细胞以长期追踪它们的变化。位于V层的一部分神经元在受伤后短期内发生细胞死亡，而位于II/III层的另一部分则能够长期存活并保持电活动。为了探究控制V层神经元死亡的机制，通过遗传手段沉默了候选的应激反应通路，轴突损伤响应的双重亮氨酸拉链激酶（DLK）对于V层神经元的死亡是必需的。这项工作为靶向DLK信号通路作为创伤性脑损伤的治疗干预提供了理论依据。此外，对轻度、亚临床损伤后神经元进行追踪的方法可以增进对神经元对重复冲击敏感性的理解。

图一 在闭合颅骨模型中表征mTBI的神经退行性变化

为了研究mTBI作者使用了一个单侧闭合颅骨损伤模型，该模型提供了与临床相关的脑震荡损伤视角，并使能够准确解析由此产生的病理级联反应。具体方法是通过控制皮层撞击伤实现的，在特定深度和速度下直接对小鼠头骨表面施加冲击。冲击由直径3毫米的尖端提供，定位在小鼠左侧的感觉运动皮层上方受伤后，小鼠没有表现出明显的长期症状或组织丢失，但在损伤同侧皮层内约2毫米直径的区域内出现了可重复的星形胶质细胞增生。这种模型导致了与轻度TBI一致的翻正反射丧失，以及神经丝轻链（NfL）这一神经元退变血清生物标志物的小但一致的增加。首先在Thy1-YFP-H小鼠中检查了病理情况，这种小鼠在V层皮层神经元中稀疏表达一种荧光蛋白，突出了它们的形态特征。在这些小鼠中组织学确认了皮层神经退行性变化。在受伤后7天（dpi），在损伤同侧皮层而非对侧观察到了退化树突、胞体和轴突的特征。通过退化指数计算量化了V层上方区域的皮层树突片段化，结果显示与对侧或假手术对照组的同侧皮层相比，仅在损伤同侧皮层中YFP+树突显著退化。在V层以下，观察到一些不对应于胞体而是病理扩大的轴突的YFP阳性结构显著增加。其中一些轴突肿胀大小与胞体相当，但都不含DAPI阳性的细胞核。这些肿胀可能反映了轴突运输的中断，导致细胞器和蛋白质的积累。也观察到了轴突珠状变性，代表轴突退化，发现轴突珠状变性和肿胀仅在损伤后7天的同侧皮层中增加。由于Thy1报告基因随机表达，且特别观察到炎症、树突和轴突病理仅发生在损伤同侧，将损伤同侧皮层中的YFP+神经元数量与每一切片的对侧皮层进行了比较。测量结果显示，在7dpi时细胞体减少了15.3%±1.8%，在14dpi时减少了26.3%±7.9%。因此，发现单次单侧感觉运动皮层上的闭合头部冲击可重复地导致损伤同侧的V层投射神经元及其各个神经元隔室的退化。

图二 mTBI会在不同亚类的皮层神经元中激活与Atf3相关的转录反应

在mTBI后7天（dpi），观察到ATF3免疫标记特异性地定位在受伤侧的皮层。在这个时间点，大约10%±2.3的YFP表达神经元也表达了ATF3。一些ATF3阳性细胞也出现在II/III层。在对ATF3和CTIP2进行染色时，未观察到双标记细胞。推测ATF3可能在TBI后抑制了皮层中的标记基因，类似于轴突损伤后外周感觉神经元的情况。为了更全面了解这些神经元的RNA表达谱，进行了单核RNA测序，在7dpi收集受伤部位的皮质组织，以便从急性期表达Atf3的细胞中分离出细胞核用于单核测序。使用多重原位杂交验证了Gfp+兴奋性和抑制性神经元的存在。有趣的是，所有中间神经元亚类都表达了抑制性神经元标记物Gad2，但缺乏其亚类标记物，包括Pvalb或Sst。捕获了在4和5dpi时表达Atf3并在7dpi时测序的神经元。其中一些仍然表达了Atf3，但许多只有低水平或不可检测的Atf3表达。相比之下，损伤诱导的神经元内肽酶Ecel1，在兴奋性和抑制性神经元中高度表达。一组损伤诱导基因在不同神经元亚类中的表达，发现并非所有激活Atf3的神经元亚类经历了相同的后续转录程序。

图三 DLK在介导神经元损伤后细胞死亡过程中的关键作用

作者观察到磷酸化的c-Jun（p-c-Jun），一种已知与ATF3结合的蛋白，在同侧皮层中的分布模式与ATF3相似。这些转录因子ATF3和p-cJun被发现是由轴突损伤感应蛋白DLK激活的。因此，推测靶向DLK可能作为一种足够上游的节点来保护神经元免受多种应激反应的影响。此外，虽然在Layer V和Layer II/III神经元中均检测到了DLK通路激活标志物p-c-Jun，但在Layer V神经元中其表达显著更高，这与它们不同的易损性相关。基于此，测试了敲除DLK是否能促进Layer V中Atf3阳性神经元的存活。DLK的敲除完全阻止了Layer V神经元的死亡，挽救了同侧皮层中约15%的神经元损失。这种挽救效果在42天后仍能在Dlk cKO动物中维持。通过将DLK cKO系与Thy1-YFP报告基因杂交，也观察到DLK cKO阻止了mTBI诱导的树突发育不良，并明显减少了（但未完全抑制）轴突珠状变性和肿胀。DLK信号对于感觉神经元招募小胶质细胞和其他炎症细胞到损伤部位至关重要。接下来还研究了DLK cKO是否局部减少了mTBI后的皮层小胶质细胞增生。在Dlk被耗尽的Layer V中，小胶质细胞增生选择性减少。有趣的是，尽管DLK对于Csf1上调以在周围神经损伤后招募小胶质细胞是必需的，但发现CSF1在mTBI诱导的皮层小胶质细胞增生中不起作用。因此，mTBI诱导的Layer V小胶质细胞增生并非通过主动招募小胶质细胞的神经元损伤反应启动，而是作为对凋亡神经元释放的因子（如ATP）的响应而发生。因此，通过DLK敲除预防神经元死亡足以防止小胶质细胞的募集。该研究发现DLK的激活对于mTBI后Layer V神经元的退化是必要的，且其在Layer V和Layer II/III神经元中的差异激活可能是导致不同易损性的原因。

总结

这项研究深化了对皮层神经元如何响应轻度创伤性脑损伤的理解，并揭示了它们反应的异质性，导致不同神经元群体有不同的易损性。研究表明，单次急性损伤后神经元应激反应的启动，可能会使存活下来的神经元对进一步的损伤更加敏感，这凸显了针对容易反复受伤的人群制定靶向治疗策略的必要性。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41467-025-56292-0

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