《食品科学》：江苏省农业科学院刘芳研究员等：单宁酸与乳清分离蛋白结合对紫苏精油抗菌乳液稳定性的影响

由微生物导致的肉类腐败是造成食物浪费的重要原因，有超过21%的食物浪费是肉类腐败引起的。在加工和运输过程中，生鲜肉容易受到微生物污染，因此控制肉制品中微生物的生长是延长肉品保质期的关键。植物精油作为一种天然抑菌剂，具有较好的抑菌效果且对人体无害，但其易挥发且稳定性差，限制了其在食品保鲜中的应用。因此，将植物精油负载在乳液体系中，可以克服其易挥发和稳定性差的问题，同时实现缓慢释放，达到长久保鲜的效果。

纳米乳液是一种在食品中被广泛使用的递送系统。蛋白质同时含有亲水基团和疏水基团，因而蛋白质是一种良好的乳化剂。蛋白质-多酚的共价偶联不仅可以提高蛋白质的氧化稳定性，而且乳化活性也得到了一定程度的提高。

江苏大学食品与生物工程学院的唐文翔、都龙，江苏省农业科学院农产品加工研究所刘芳*等采用荧光光谱法和红外光谱法研究了单宁酸（TA）与不同种类蛋白质的相互作用，发现TA与乳清分离蛋白（WPI）结合形成的复合物能够显著提高乳液的稳定性。本研究为蛋白-TA二元复合物的合成和易挥发物质的包埋提供了思路，拓宽了纳米乳液在食品工业中的应用。

1 不同蛋白-TA复合物的分析

1.1 不同蛋白-TA复合物荧光光谱分析

不同蛋白及蛋白-TA复合物内源荧光光谱如图1所示，随着TA含量的增大，WPI、SPI、CS和OVA的荧光强度都出现了一定程度的减小，WPI和CS的最大发射波长出现了微小红移，SPI和OVA出现了微小蓝移，说明TA的加入改变了蛋白质的结构，且对WPI和CS有较强的荧光猝灭作用。根据Stern-Volmer方程计算的蛋白-TA相互作用如表1和图2所示，WPI、SPI、CS和OVA的猝灭速率常数Kq均大于最大动态猝灭速率常数2×1010 L/（mol·s），均属于静态猝灭，说明TA与WPI、SPI、CS和OVA都形成了复合物而引起静态猝灭。而WPI结合位点数n＝1.65，大于其他蛋白质，说明在碱性反应过程中，WPI有最多的结合点位。Chen Yang等的研究表明，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）和TA等不同多酚对牛血清白蛋白都有一定程度的荧光猝灭作用，由于TA具有较多的羟基而能与蛋白形成强相互作用；Xu Qianda等的研究表明，与肌原纤维蛋白（MP）相比，没食子酸（GA）、EGC、TA和EGCG与MP交联的复合物荧光光谱波峰发生红移，MP的结构发生改变。

1.2 FTIR分析

酰胺I带的拟合面积可以反映蛋白质二级结构含量的变化，即

2 不同因素对乳液粒径、电位、PDI和包埋率的影响

为评价纳米乳液的包埋率，测定了溶解于10%乙醇溶液中的不同添加量PEO在292 nm处的吸光度绘制标准曲线，其公式为y＝0.0061x＋0.05452，R2＝0.9986，说明在该添加量范围精油吸光度和添加量呈良好线性关系。

2.1不同蛋白对乳液粒径、电位、PDI和包埋率的影响

以SPI、CS、OVA和WPI为乳化剂制备乳液的结果如图3所示。当WPI-TA为乳化剂时，纳米乳液的粒径最小（（292.30±1.96）nm）、电位绝对值较大（（-62.50±0.29）mV）、包埋率最高（（74.51±0.35）%），是该方法制备的最稳定的纳米乳液。这可能是由于在碱性反应的条件下，WPI与TA的作用位点更多，且同时形成了较强的非共价相互作用，进而表现出更好的乳化性能。Wang Xiaoya等制备了以α-乳清蛋白与CA和EGCG共价结合稳定的纳米乳液，其粒径仅为（204.9±2.8）nm和（204.6±3.3）nm；Xiong Yating等的结果表明，乳清蛋白-TA偶联物可以形成更加平衡的亲水/疏水界面，使蛋白质更适合在油水界面吸附。

2.2 油水比对乳液粒径、电位、PDI和包埋率的影响

从图4可知，油相的比例增加到30%时，乳液粒径开始发生显著变化（P＜0.05），从（292.93±1.95）nm增加到（731.8±14.81）nm，PDI由0.260±0.012上升到0.539±0.017，包埋率由（74.52±0.35）%下降到（51.11±2.51）%，这是由于水相中的蛋白不足以包裹油滴，未被蛋白吸附的油滴之间静电斥力低，发生聚集，加速了奥斯特熟化，乳液变得不稳定。当乳液中油相占比为10%时，纳米乳液具有最小的粒径，最大的电位绝对值和包埋率，说明在该体系下，油相比例为10%时乳液最稳定。段方宇等发现，当油相比例为10%，葡萄籽油/大米水解蛋白复合乳液的粒径最小（（0.894±0.013）μm），具有最好的稳定性；黄欢等发现，当油相比例高于15%时，游离油的比例增大，无法覆盖在蛋白纳米颗粒表面，导致乳液液滴之间发生聚集。

2.3 超声功率对乳液粒径、电位、PDI和包埋率的影响

如图5所示，当超声功率为0 W时，乳液粒径为（3469.33±258.62）nm，Zeta电位为（2.49±0.91）mV，此时乳液最不稳定，当超声功率为225 W时，乳液液滴的粒径显著减小（P＜0.05），包埋率显著增大（P＜0.05），Zeta电位呈负电。当超声功率达到675 W时，乳液粒径最小（（292.33±1.95）nm），PDI 最小（0.260±0.012），电位绝对值最大（（-62.5±0.294）mV），包埋率最大（（74.51±0.346）%），是该体系下最稳定的乳液。这是由于超声处理可以使蛋白质更好地展开，疏水基团一侧与油滴接触包裹在油滴外，形成稳定的乳液。但是当超声功率为900 W时，乳液粒径和PDI显著增大（P＜0.05），Zeta电位绝对值和包埋率显著减小（P＜0.05），这可能是由于超声的热效应和油滴之间的频繁碰撞使油滴形状不规则，同时空化效应过强导致小液滴重新聚集在一起。

由上述结果可以得出，以WPI为乳化剂、油相比例为10%、超声功率为675 W时，超声乳化法制备的O/W乳液具有最好的稳定性，并将该乳液命名为WPI-NE。

3 WPI-NE纳米乳液微观结构的分析

3.1 WPI-NE纳米乳液CLSM和SEM观察结果

从图6A～C可以看出，被耐尔兰A染成绿色的WPI和被尼罗红染成红色的PEO呈现出相同的分布，说明经过超声乳化后WPI-TA纳米颗粒与PEO结合，形成稳定的液滴。从图6D可以看出，WPI-NE的液滴呈现出的蛋白形状不规则，说明蛋白包裹在油滴外，形成了O/W结构的乳液液滴。

3.2 WPI-NE纳米乳液FTIR分析

如图7所示，WPI在3295、1636、1523 cm-1处出现特征吸收峰，分别对应N—H伸缩振动/氢键、C—O伸缩振动/氢键和C—H伸缩振动—N—H弯曲模式，TA在3391 cm-1和1760 cm-1处出现两个体征吸收峰，对应O—H伸缩振动。由于2-己酰基呋喃、百里香鲲、石竹烯是PEO的主要成分，这些化合物富含O—H、C—H、—CH2、C—C、—CO、C—O和C—O—C基团，因此其吸收峰在600～3600 cm-1广泛分布。而WPI-NE在3281 cm-1（O—H收缩振动）、2917 cm-1和2862 cm-1（O—H收缩振动）、1645 cm-1和1413 cm-1（COO—伸缩振动）、1320 cm-1和1118 cm-1（C—O伸缩振动）、1145 cm-1和1025 cm-1（O—H收缩振动）处出现吸收峰。与PEO的吸收峰相比，WPI-NE纳米乳液在3281、1599 cm-1和1521 cm-1处出现了与WPI相似的峰，说明存在部分没有与结合，在1645 cm-1和1118 cm-1处相比PEO出现了偏移，说明存在部分PEO未被蛋白包裹，在1025 cm-1处出现了新的峰，说明蛋白和油滴之间形成了新的且强度较大的氢键。由此可以看出，WPI-NE纳米乳液中WPI包裹在油滴外，且与PEO之间形成了较强的化学键，制备出了稳定的WPI-NE纳米乳液。

4 WPI-NE纳米乳液精油损失率的分析

如图8 所示，1 h 内PEO 的损失率为（0.26±0.07）%，而WPI-NE纳米乳液中PEO的损失率仅为（0.05±0.01）%。8 h后PEO的损失率已经达到（0.94±0.28）%，WPI-NE纳米乳液中PEO的损失率为（0.33±0.06）%，显著低于PEO（P＜0.05），仅为PEO的1/3，表明该乳液体系能有效降低PEO的损失，为解决PEO易挥发的问题提供了思路。

5 WPI-NE纳米乳液稳定性的分析

5.1 热稳定性和离子稳定性的分析

从图9A、B可以看出，50 ℃处理后的乳液粒径减小，这可能是由于温度升高，油水界面张力降低，静电斥力增大，减小了乳液液滴之间的碰撞概率，液滴不易聚集。随着温度继续升高，乳液的平均粒径显著增大（P＜0.05），粒径开始呈现双峰分布，且峰值降低，峰宽增大，这是由于随着温度升高蛋白质发生变性，蛋白与油滴之间的相互作用减弱，乳液液滴发生聚集，这与魏晓晶等的研究结果相似。但是WPI-NE纳米乳液的粒径和PDI仍保持在较低水平且未发生分层，说明该乳液具有良好的热稳定性。

NaCl含量对WPI-NE纳米乳液稳定性的影响如图9C、D所示。 当NaCl质量分数≤1%时，乳液粒径分布呈现出单峰，且添加1%的NaCl还能略微降低乳液的平均粒径，这可能是因为NaCl的加入产生了静电屏蔽效应，使液滴的疏水性增加，液滴分布更均匀。 当NaCl质量分数＞1%时，乳液平均粒径显著增大且呈现出多峰分布（P＜0.05），这可能是由于蛋白质分子表面的水化层和双电层被破坏，且同时发生盐析作用导致大分子聚集，这与刘炯娜等的结果相似。 该结果说明，NaCl质量分数≤1%时，WPI-NE纳米乳液具有较好的稳定性。 来昊的研究表明，0～200 mmol/L的NaCl溶液会增大WPI的静电屏蔽作用和表面疏水性，增强WPI的溶解性，减少乳液液滴的聚集。

5.2 冻融稳定性的分析

从图10可以看出，经过3 次冻融后，乳液出现了一定程度的分层现象，说明WPI-NE纳米乳液冻融稳定性较差，不适宜在过低的温度环境中应用。在冻融过程中会发生油相、水相的结晶、蛋白质构象变化和界面向转变等变化，乳液中可自由流动的水减少，处于界面的蛋白质无法被水化，且乳液液滴被冰晶挤压发生破乳现象，导致乳液出现分层。

5.3 贮藏稳定性的分析

从图11可看出，随着贮藏时间的延长，粒径分布的峰逐渐出现右移，乳液粒径增大（P＜0.05），在第28天粒径增加到487 nm，出现了一定程度的分层。魏晓晶和雷丹丹等的结果也表明，随着贮藏时间的延长，乳液的平均粒径增大，且粒径分布开始呈现多峰。但是在第28天乳液的PDI仍处于较低的水平，说明乳液分散度良好，具有良好的贮藏稳定性。

6 WPI-NE纳米乳液抑菌效果的分析

6.1 WPI-NE纳米乳液抑菌和杀菌结果

利用PEO处理E.coli和B.subtilis，发现PEO对E.coli的MIC≥2.50 mg/mL，对B.subtilis的MIC≥10 mg/mL。从图12A可以看出，当乳液中PEO质量浓度≥6.25 mg/mL时，E.coli和B.subtilis不会在平板上生长，高于PEO对B.subtilis的MIC，但是低于对E.coli的MIC。因此WPI-NE纳米乳液对E.coli和B.subtilis的MIC为6.25 mg/mL，因此杀菌实验采用乳液PEO质量浓度为12.5 mg/mL。从图12B、C可以看出，经过12.5%（体积分数）的抗菌纳米乳液处理2 h后，E.coli的菌落总数从9.71（lg（CFU/mL））减少到6.61（lg（CFU/mL）），B.subtilis的菌落总数从8.68（lg（CFU/mL））减少到5.65（lg（CFU/mL）），且抗菌纳米乳液对B.subtilis有较好的瞬时杀菌效果，在极短的时间内减少了1.93（lg（CFU/mL）），说明WPI-NE纳米乳液对E.coli和B.subtilis有较好的抑菌和杀菌效果，且对B.subtilis有较好的瞬时杀菌作用。

6.2 乳液处理对

E.coli

B.subtilis

从图13可以看出，未经乳液处理的B.subtilis和E.coli细胞形态完整、饱满，细胞膜结构完整，在CLSM下观察到绿色活菌明显多于红色死菌；经乳液处理后，B.subtilis细胞表面出现明显的缺陷，细胞膜被破坏，内容物流出，E.coli的细胞表面出现褶皱，细胞发生畸形，在CLSM下观察到红色死菌大量出现，表明WPI-NE纳米乳液可以通过破坏细菌细胞膜破坏细胞结构，进而杀死细菌。Zhou Qi等的结果表明，PEO能够破坏粪肠球菌的细胞形态，改变细胞膜电位，破坏细胞膜。

结 论

本实验探究TA与不同种类蛋白碱性条件下的共价结合对蛋白结构和PEO纳米乳液稳定性的影响，并对乳液的抗菌性能进行评估。通过内源荧光测定和FTIR对加入TA前后蛋白的三级结构和二级结构进行测定，发现碱性条件下TA的加入对WPI的结构影响最显著，二者结合位点最多（n＝1.65），形成的复合物最稳定，利用其制备的乳液具有高稳定性。通过比较不同超声功率和油水比例制备的乳液，发现超声功率675 W、油水比1∶9时乳液粒径最小（（292.3±1.96）nm）、电位绝对值较大（（-62.50±0.29）mV）、包埋率最高（（74.51±0.35）%）。以WPI-TA纳米颗粒为乳化剂制备的乳液稳定性良好，在4 ℃贮藏28 d仍具有较高的稳定性。乳液包埋能够解决PEO易挥发的问题，同时还具有较好的缓释性能和抗菌性能。本研究为蛋白-多酚二元复合物的合成和易挥发物质的包埋提供了思路，拓宽了纳米乳液在食品工业中的应用。

作者简介

通信作者：

刘芳，博士，江苏省农业科学院农产品加工所三级研究员，硕士生导师，一直从事肉制品加工及质量安全控制方面的研究，在腐败菌分析检测和致腐机制、生物源保鲜剂的抗菌机制及新型抗菌包装材料的研发等方面取得了一系列原创性成果。先后主持国家自然科学基金面上项目（2 项）、国家自然科学青年基金等省部级项目12 项，以第一作者和通信作者在国内外学术刊物上发表相关论文70余篇（其中SCI一区Top论文26 篇）；以第一完成人授权国家专利6 项。以主要完成人参与的研究成果“禽肉工业化加工共性关键技术及其产业应用”获2020年度江苏省科学技术奖一等奖。

本文《单宁酸与乳清分离蛋白结合对紫苏精油抗菌乳液稳定性的影响》来源于《食品科学》2024年45卷第12期90-100页，作者：唐文翔，都 龙，王在天，孙芝兰，刘芳*，王道营。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231007-030。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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