《食品科学》：武汉轻工大学金伟平教授等：油茶储藏蛋白提取过程组分迁移对其功能特性的影响

油茶（Camellia oleifera Abel.）为山茶科山茶属，是世界四大木本油料之一，也是是我国特色油料作物。在制油过程中，外力使细胞破碎，导致蛋白质溶出后遇到细胞间隙中多酚等小分子，发生相互作用，从而产生伴随提取，影响蛋白质的色泽与风味。皂素是油茶蛋白提取过程中高含量的伴随物，味苦色深，目前研究常采用有机溶剂预处理、双氧水脱色等方式去除。但有机溶剂与强氧化剂的预处理往往导致蛋白质变性、溶出率和提取率降低、蛋白质功能活性受限。

武汉轻工大学食品科学与工程学院的杨晓莉、金伟平和中国农业科学院油料作物研究所周际松等采用蛋白质组学鉴定油茶籽总蛋白的种类，聚焦提取过程中蛋白质和皂素的迁移规律，评价不同组成蛋白质的起泡性、乳化性等功能特性，以期为油茶蛋白的提取和综合应用提供参考。

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油茶籽蛋白组学分析

本研究先采用蛋白质组学技术分析了油茶籽中蛋白质的组成，为后期提取过程的定向设计铺垫。鉴定结果显示，油茶籽中总蛋白数量为2 577 个，通过基因本体（GO）分析对蛋白质进行注释（图1），油茶蛋白中涉及细胞组分的数量最多，占总蛋白数的41.8%，其与细胞内部结构与胞内转运息息相关。注释到的油茶蛋白生物学过程主要为有机物合成代谢，包含酰基辅酶A氧化酶、氨基酸氨基转移酶等蛋白酶，它们参与氨基酸的转运和代谢调控，为油茶籽成熟过程中合成蛋白质提供了保障。

通过京都基因和基因组数据库（KEGG）注释对蛋白质相关功能与作用通路分析，结果如图2所示，茶籽中大多蛋白质参与代谢通路，占总蛋白数量的73.7%。例如，碳水化合物代谢为油茶籽萌发提供能量，参与其过程的蛋白质数量为336 个。其他相关代谢通路主要涉及糖酵解/糖原异生作用、丙酮酸盐代谢、内质网蛋白质加工等，其中内质网蛋白质加工通路是油茶储藏蛋白积累的重要方式，储藏蛋白在粗面内质网上以前体的形式合成，然后从内质网经多条途径运输至蛋白体中储存。食品加工中蛋白质提取即促进蛋白体中高密度储藏蛋白充分溶出，并维持稳定构象的过程，碱提酸沉法是提取油料储藏蛋白最常用方法之一。

02

油茶贮藏蛋白提取工艺条件优化

采用碱提酸沉法提取总储藏蛋白，依次对料液比、碱提和酸沉pH值进行参数优化。如图3A所示，随着料液比的增加，提取率呈现先增加后稳定的趋势，在料液比超过1∶10后，蛋白质溶出过程接近饱和。皂素/蛋白比值随着料液比的增加先减小后增大，在1∶10、1∶20皂素/蛋白比值达到最低，因此选取料液比1∶10继续优化。如图3B所示，提取率随pH值增大而逐步增加，皂素/蛋白比值也持续增大，且高pH值易引发油茶多酚氧化为醌类物质，导致蛋白质褐变。综上因素，选用pH 8.0为碱提参数，此时蛋白质提取率为75.8%，皂素/蛋白质比值为2.60。

酸沉富集过程蛋白质和皂素的分布如图4所示。随着pH值降低，上清蛋白质（SUP）含量呈现先减小后增加的“U”型趋势（图4A）。即pH值接近等电点时，蛋白质分子所带的净电荷逐渐接近于零，分子间静电斥力的减小使蛋白质发生聚集。在pH值低于等电点后，蛋白质净电荷增加，又逐渐溶解于上清液中。上清液中蛋白质占总储藏蛋白的比例在pH 3.5时达最低值（56.4%），与之对应的沉淀蛋白（SED）占比最高达38.8%（图4B）。油茶皂素在酸性条件下易被水解成苷元，水溶性降低，随pH值的减小，上清皂素占比呈现“S”型变化趋势（图4C）。当酸沉pH 3.0时，上清液中皂素和蛋白质含量均达到最低水平，无法实现两者的有效分离。与何玮通过沉淀量优化油茶粕蛋白提取的最佳pH值为3.5的结果表现出差异，原因推测为：一方面清蛋白水溶性好，和部分皂素共存于上清液中，很难通过溶解度差异分离；另一方面皂素与蛋白质相互作用能增加蛋白质溶解度，难以沉淀形式分离。

进一步记录酸沉过程沉淀量和沉淀与上清液中皂素/蛋白的比值随pH值的变化关系（图5）。本研究发现随pH值降低，酸沉沉淀量逐渐增加，未出现“钟形”曲线，且沉淀中皂素/蛋白比值也持续增加，推测在pH＜2.5时，蛋白质和皂素发生共沉淀。在pH＞2.5时，沉淀中皂素/蛋白比值随pH值的增加而减小，然而在pH 4.5～5.0时，沉淀中皂素/蛋白比值较低，约为0.36，有利于获得高纯度蛋白质。

对酸沉过程上清液和沉淀中蛋白质组分进行SDS-PAGE分析发现，上清液中蛋白质条带集中在13～16 kDa（图6）。上清液中主要蛋白质为清蛋白。沉淀中条带分布变化随酸沉pH值而变化，在pH 4.5～5.0时，沉淀中18.6 kDa和33.0 kDa条带分别为11S球蛋白的碱性亚基和酸性亚基；在pH 3.0～4.0区段，沉淀中新出现的56.1 kDa和63.1 kDa条带为7S球蛋白的特征亚基；当pH值在1.5～2.5范围，沉淀中的11S球蛋白溶解于上清液中。因此，在酸沉过程中，清蛋白溶解性好，大部分保留在上清液中；11S球蛋白存在于pH 3.0～5.0沉淀中，7S球蛋白存在于pH 3.0～3.5的沉淀中。综合图5结果，选取pH 4.5进行酸沉分离得到高纯度11S球蛋白，约占总储藏蛋白69%的清蛋白与7S球蛋白和皂素的伴随难以沉淀分离，皂素/蛋白比值为3.73。

如表1所示，在AEP中含有cupin结构域的蛋白质、Bet v I/乳胶蛋白家族蛋白质丰度较高，根据序列比对综合分析（图7），这两个结构域分别对应于球蛋白和2S清蛋白。AEP主要由11S球蛋白、7S球蛋白和2S清蛋白组成。在pH 4.5 SUP中，Bet v I/乳胶蛋白和含有cupin结构域的蛋白质丰度高，结合SDS-PAGE结果分析存在2S清蛋白与7S球蛋白，而pH 4.5 SED中含有cupin结构域的蛋白质丰度最高，主要为11S球蛋白。

通过序列比对发现油茶11S球蛋白与大豆球蛋白Glycinin G3序列覆盖度达96%，序列比对相似度为45.6%，属于11S豆科植物种子储藏球蛋白的N端结构。油茶7S球蛋白与拟南芥种子储藏蛋白豌豆球蛋白At2g28490相似度为53.5%，属于7S球蛋白的N端结构。2S清蛋白与拟南芥Bet v I超家族中MLP-like protein 423蛋白质相似度为55.7%。

为探究油茶储藏蛋白与皂素结合紧密程度，将11S球蛋白、7S球蛋白与2S清蛋白依次与茶皂素A9进行分子对接，结果如图8所示，茶皂素A9与7S球蛋白结合最稳定，结合自由能为－182 kJ/mol，其中7S残基苯丙氨酸24、赖氨酸23、苯丙氨酸140通过疏水作用力，天冬氨酸138、苯丙氨酸140、天冬氨酸137、谷氨酰胺148通过氢键与皂素分子互作。茶皂素A9与11S结合自由能为－40.1 kJ/mol，皂素与11S残基丝氨酸339、谷氨酸119、精氨酸337形成氢键，与残基精氨酸340形成一个π阳离子键。茶皂素A9与2S清蛋白结合自由能过低，未表现出明显相互作用，结果表明皂素与7S球蛋白的强烈互作使两者难于分离。

03

油茶储藏蛋白的功能性质

蛋白质溶解性反映了蛋白质的水合作用能力，如图9所示，不同油茶储藏蛋白组分的溶解度在pH 2.0～9.0范围呈先降低后升高的“V”型趋势。3 种蛋白样品（AEP、SUP、SED）在pH 4.0时溶解度均最小，其中SUP以清蛋白为主，在不同pH值条件下都具有较高的溶解度，在pH 4.0时溶解度也达46.3%。

如图10所示，蛋白AEP起泡性最高（231%），SUP和SED的起泡性约为210%，均显著高于商品大豆分离蛋白（SPI）。SED的泡沫稳定性为85.9%，与AEP（79.0%）和SUP（77.3%）无显著差异，但略低于相应含量的皂素溶液，此时皂素与蛋白质共存，未形成协同增效稳定。AEP、SUP和SED的乳化活性指数无显著差异，为16.7 m2/g，约是商品SPI（7.73 m2/g）的2 倍。3 种蛋白样品AEP、SUP、SED乳化稳定性指数远高于相应的皂素溶液，其中SUP乳化稳定性指数最高（262 min），表明油茶清蛋白-皂素复合体系在乳液的稳态化方面具有一定的潜力。

结论

本研究分析了油茶储藏蛋白在提取过程中皂素与球蛋白、清蛋白伴随迁移规律，及其对蛋白质组成和功能性质的影响，结果表明，在酸沉过程中pH＜2.5时，蛋白质和皂素发生共沉淀，相反地，pH＞2.5时，清蛋白和皂素富集在上层清液。受限于溶解度的同步性和7S球蛋白/皂素互作增溶，传统方法难以获得高纯度蛋白，而11S球蛋白与皂素结合能力较弱，易于沉淀富集。蛋白质与皂素的共存可以显著增强蛋白质的起泡性、乳化性，在制备新型功能性配料方面具有很大潜力，为油茶储藏蛋白高附加值产品的挖掘和开发提供了思路。

本文《油茶储藏蛋白提取过程组分迁移对其功能特性的影响》来源于《食品科学》2024年45卷第11期91-99页，作者：杨晓莉，周际松，尚 伟，彭登，邓乾春，金伟平。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20231011-084。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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