山东大学全国重点实验室博士研究生以第一作者身份在《Nature》旗下期刊发表研究成果

1月17日，Nature Communications在线发表了山东大学微生物改造技术全国重点实验室王海龙教授课题组的研究论文“Improving polyketide biosynthesis by rescuing the translation of truncated mRNAs into functional polyketide synthase subunits”。王海龙教授为论文通讯作者，博士研究生刘焱为论文第一作者。山东大学微生物改造技术全国重点实验室为第一完成单位和通讯作者单位。

聚酮化合物是一大类结构丰富和活性多样的天然产物，是人类的药物宝库，包括生物农药丁烯基多杀菌素、阿维菌素，免疫抑制剂雷帕霉素，抗癌药物埃博霉素等。负责它们生物合成的聚酮合酶由若干个功能模块组成，相邻聚酮合酶蛋白间通过对接结构域介导的蛋白质相互作用形成多酶复合体。模块化聚酮合酶是细菌中最大的蛋白质，编码聚酮合酶的基因通常大于10kb并组成操纵子，它们的mRNAs比普通基因的mRNAs长很多。mRNA越长被截断的风险越大。

图1 拆分BusA为独立翻译的聚酮合酶亚基促进丁烯基多杀菌素合成

为了探究截断的聚酮合酶mRNAs对聚酮生物合成的影响，该研究选择了负责丁烯基多杀菌素生物合成的模块化聚酮合酶基因busA（13 kb），因为它最接近操纵子启动子，并且它编码的三模块BusA蛋白（456 kDa）模块数量对于拆分来说是适中的（图1a）。利用该课题组开发的RedEx基因无痕定点突变技术（Nucleic Acids Research, 2020, 48(22), e130; Nature Protocols, 2024, 19(11), 3360-3388），根据BusA蛋白的模块组成将其拆分为一个双模块蛋白和一个单模块蛋白，或者将其拆分为三个单模块蛋白（图1b）。BusA蛋白拆分时需要移除两个相邻模块之间的接头（linker），因此，为了维持聚酮合酶模块在多酶复合体中的正确顺序，将两个相邻的盐霉素聚酮合酶对接结构域分别移植到BusA蛋白拆分模块的相应位置（图1b）。发酵结果显示，BusA蛋白拆分提高了丁烯基多杀菌素的生物合成效率，其中拆分为一个双模块蛋白和一个单模块蛋白使产量提高5~6倍，拆分为三个单模块蛋白使产量提高13倍（图1c）。

图2 拆分AveA2/EpoD为独立翻译的聚酮合酶亚基促进阿维菌素/埃博霉素合成

为了测试这种蛋白拆分方法是否适用于其它聚酮合酶，该研究分别选择了阿维菌素聚酮合酶中最大的四模块蛋白AveA2（666 kDa，编码基因19 kb）和埃博霉素聚酮合酶中最大的四模块蛋白EpoD（764 kDa，编码基因22 kb）（图2a），它们分别被拆分为两个双模块蛋白。与BusA蛋白拆分时相同，在移除两个相邻模块之间的接头时，将两个相邻的异源聚酮合酶对接结构域分别移植到拆分模块的相应位置（图2b和d），用于维持聚酮合酶模块在多酶复合体中的正确顺序。发酵结果显示，AveA2蛋白拆分使阿维菌素产量提高5倍（图2c），EpoD蛋白拆分使埃博霉素产量提高10倍（图2e）。

图3 野生型和拆分型聚酮合酶基因的转录和翻译模型

进一步检测野生型和拆分型busA基因在链霉菌中的转录和翻译，发现截断的mRNA构成了大部分（>93%）的聚酮合酶mRNA，因此越靠近启动子mRNA丰度越高，进而导致聚酮合酶蛋白越靠近N端肽段丰度越高（图3a）。在细菌中，转录和翻译偶联致使完整的和截断的mRNA均被翻译。由于截断的mRNA不含终止密码子，在截断的mRNA上执行翻译功能的核糖体不能正常解离，导致核糖体被困在截断的mRNA上，此时核糖体拯救系统被激活以释放停滞的核糖体, 同时截断的mRNA被翻译成不含C端结构域的无功能多肽。当细菌中主要的核糖体拯救系统tmRNA-SmpB被用于拯救停滞的核糖体时，截断的聚酮合酶片段的C端被添加SsrA标签，随后被细胞内蛋白酶降解（图3a）。因此，截断mRNA的转录和翻译造成了细胞资源浪费。

通过在模块编码序列之间插入CDD（C端对接结构域）-TGA（终止密码子）-RBS（核糖体结合位点）-ATG（起始密码子）-NDD（N端对接结构域）编码序列来拆分多模块聚酮合酶基因，可以拯救截断mRNA的翻译，并产生功能性聚酮合酶亚基（图3b）。由于截断的mRNA构成了大部分的聚酮合酶mRNA，因此该拆分方法会使N端聚酮合酶亚基浓度显著升高，这些聚酮合酶亚基通过末端对接结构域介导的蛋白相互作用形成功能性聚酮合酶复合体，进而提高生物合成效率。

该研究开发的聚酮合酶截断mRNA翻译拯救策略丰富了聚酮化合物途径工程的工具箱。该方法可以与已知的工程策略相结合，以提高聚酮药物的生物合成效率。此外，该方法还可应用于其它多模块或多结构域组成的大型蛋白的工程改造，以增强它们的功能。

该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、山东省自然科学基金、山东大学杰出中青年学者基金等项目资助。

来源：山东大学