Nat Biotechnol | 复杂在体模型的高分辨率遗传筛选新策略—CRISPR-StAR

撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现让高通量遗传筛选成为可能。以此为基础的全基因组高通量遗传筛选在癌细胞等多种细胞中揭示出众多影响细胞功能的关键基因【1】。尽管如此，由于现有的CRISPR高通量筛选主要局限于传统的2D细胞，因此难以发现有价值的治疗性靶点。这主要是因为2D细胞存在很多缺陷与不足，在细胞增殖速度、促癌基因外显率以及微环境等方面与在体模型存在明显差异，很多治疗性靶点的鉴定更依赖在体模型研究【2,3】。尽管目前已有成功的在体高通量遗传筛选研究，但相关工作主要集中于少数易于移植且高癌变的模型中，或是局限于小规模的筛选文库【4-6】。限制在体高通量筛选研究进步的关键因素主要是低移植存活率和细胞异质性生长导致的高背景噪声，这导致传统高通量筛选难以精准鉴定出关键的功能基因。

近日，来自奥地利分子生物技术研究所 （IMBA） 的Ulrich Elling实验室在Nature Biotechnology发表题为CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models的论文。文章基于CRISPR-Cas9系统，结合单细胞标签技术和Cre重组酶依赖的sgRNAs开关体系，开发出了适配复杂在体模型的新型高通量遗传筛选策略CRISPR-StAR。该策略通过Cre重组调控sgRNAs的活化与失活，可针对每种sgRNA设置单细胞水平的平行内参，最终克服背景噪声干扰，提升在体筛选效果。

经典CRISPR筛选通常需要达到500-1000细胞/sgRNA的覆盖度，或需要0.5-1*108量级的细胞总数才能有效克服随机噪声干扰。考虑到在体研究中细胞移植后的低存活率，以及细胞转导和克隆异质性增殖的影响，复杂在体模型中很难有效开展经典CRISPR筛选。研究者首先采用携带独特分子标签UMI的全基因组CRISPR文库对肿瘤细胞进行单细胞标记后进行移植分析，发现百万级肿瘤细胞体内移植后可检测的UMI种类只有4800-20500种，表明多样性丢失严重。此外，移植后形成的肿瘤组织中，可检测UMI标签的丰度差异巨大，其中高丰度标签仅有22-536种。以上分析证实了经典CRISPR体内筛选所面临的巨大噪声干扰：移植后肿瘤细胞存活数量仅为经典全基因组文库sgRNAs数量的1/5-1/30，而且成瘤过程中的UMI丰度变化也超出了经典CRISPR筛选的分辨能力。

为克服以上难题，研究者设计出一种全新的CRISPR-StAR筛选策略。该策略的优势体现在：（1）移植细胞度过生存瓶颈后才开始筛选，可克服sgRNAs多样性随机丢失的难题；（2）单细胞克隆可通过UMI进行有效示踪和评估；（3）设有单细胞水平的内参照，能有效克服细胞类型和微环境异质性带来的噪声。CRISPR-StAR的核心设计思路是团队早期开发的CRISPR-Switch系统，该系统利用Cre重组酶精准调控sgRNAs的活化与失活，最终在每种UMI标记的单细胞可控中诱导形成sgRNAs活化与失活的两大细胞群，其中携带失活sgRNA的细胞群可作为内参照指导每种sgRNA的功能筛选。

基于第一代CRISPR-StAR载体骨架，研究者构建了靶向1245种基因的sgRNAs文库 （sgRNAs种类为5870种） ，并在稳定表达Cas9和Cre：：ERT2的小鼠胚胎干细胞mESCs中对新策略进行评估。研究发现，通过对UMI标记的单细胞克隆中活化/失活sgRNAs的比例进行计算分析， CRISPR-StAR高通量遗传筛选策略的可重复性更高，且在低覆盖度条件下效果更好。

为进一步改善CRISPR-StAR，特别是优化sgRNAs活化/失活细胞群的比例，研究者对载体骨架做了系统性改进，其中StAR 4GN载体骨架为基础的sgRNAs活化/失活细胞群比例从传统骨架的35-41%提升至55-45%。为验证系统的有效性，研究者随后构建了人源和小鼠源特异性的全基因组文库，并在Yumm1.7 450R小鼠黑素瘤细胞系 （该细胞系携带BrafV600E、Cdkn2a和Pten缺失突变，且耐受Braf抑制剂） 中开展体外和在体高通量筛选。与传统筛选策略相似，CRISPR-StAR系统的体外筛选能有效鉴定出靶向关键/非关键基因的sgRNAs。在体筛选时CRISPR-StAR系统对靶向关键基因的sgRNAs具有更高分辨率。举例而言， 在体筛选中会有12.8%的活化sgRNAs无法被检测到，这存在两种可能性：一是这类sgRNAs靶向关键基因，二是移植成瘤时携带这类sgRNAs的细胞随机丢失。传统在体筛选策略无法区分这两类sgRNAs，而CRISPR-StAR可通过失活sgRNAs细胞检测区分两者，从而更好的鉴定影响细胞功能的关键基因。最后，通过比较新型CRISPR-StAR与传统MAGeCK的筛选结果，研究者进一步证实了CRISPR-StAR的优越性。最后，研究者还证实，CRISPR-StAR能有效鉴定出体内特异的黑素瘤关键基因，这类关键基因的功能在不同物种来源的细胞中具有一致性，从而证实了CRISPR-StAR筛选靶点的跨物种保守性。

总体而言，研究者成功的将CRISPR-Cas9与Cre重组酶依赖的sgRNAs活化/失活体系相结合，开发出了新型在体高通量遗传筛选策略CRISPR-StAR。该策略通过sgRNAs的活化与否设置sgRNA特异性的内参对照，可有效克服细胞异质性和遗传漂移带来的背景噪声，因此可实现复杂在体模型内的高分辨率高通量遗传筛选，且筛选结果高度可重复性，是在体治疗性靶点筛选鉴定研究的新利器。

https://doi.org/10.1038/s41587-024-02512-9

制版人：十一

参考文献

1. DepMap Broad. DepMap 23Q4 Public. https://doi.org/10.25452/figshare.plus.24667905.v2 (2023).

2. Miller, T. E. et al. Transcription elongation factors represent in vivo cancer dependencies in glioblastoma.Nature547, 355 (2017).

3. Possik, P. A. et al. Parallel in vivo and in vitro melanoma RNAi dropout screens reveal synthetic lethality between hypoxia and DNA damage response inhibition.Cell Rep.9, 1375–1386 (2014).

4. Han, K. et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities.Nature580, 136–141 (2020).

5. Miller, T. E. et al. Transcription elongation factors represent in vivo cancer dependencies in glioblastoma.Nature547, 355 (2017).

6. Chen, S. et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.Cell160, 1246–1260 (2015).

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