信阳师范团队Nature子刊发文，工程化大肠杆菌合成羟基酪醇

羟基酪醇是一种具有强抗氧化活性的天然化合物，广泛存在于橄榄果实和叶片中。作为一种备受关注的生物活性物质，羟基酪醇在预防心血管疾病、调节脂质代谢以及抗炎等领域展现了重要的健康效益，因此在食品、医药等行业中具有广泛的应用。

然而，传统的羟基酪醇提取方法面临着诸多挑战，例如从橄榄油生产过程中的废水中提取的工艺复杂且成本高昂；化学合成法生产成本高、反应条件苛刻且存在环境污染问题，难以满足可持续发展的需求；光催化方式生产转化率低、最终产物浓度低，尚未在工业生产中广泛应用。

近年来，随着绿色化学与生物制造技术的兴起，利用微生物工程和酶催化技术生产羟基酪醇成为一个备受关注的研究方向。工程化微生物在这一过程中扮演了“细胞工厂”的角色，能够通过高效表达多种酶实现复杂的生物合成反应。相比传统方法，这种策略不仅更加环保，还具有反应条件温和、催化效率高等显著优势。

近日，来自信阳师范大学的熊天真等人在 Nature 子刊 Scientific Reports 上发表了题为“Multienzyme cascade for synthesis of hydroxytyrosol via engineered Escherichia coli ”的文章，通过导入 5 种外源基因，他们构建了生产羟基酪醇的大肠杆菌，通过多酶级联反应显著提升了羟基酪醇的产量。通过质粒优化、反应条件优化和分批补料放大生产的综合策略，成功将羟基酪醇的产量提高了 89%，达到 55.3 mM，为羟基酪醇的生产提供了一种新方法。

为了高效合成羟基酪醇，研究团队利用工程化大肠杆菌作为“细胞工厂”，构建了一条包含 5 种关键酶的级联反应路径，包括酪氨酸酚裂解酶（TPL）、氨基酸脱氢酶（aadL）、α-酮酸脱羧酶（KAD）、醛还原酶（yahK）和葡萄糖脱氢酶（gdh）。

首先，通过酪氨酸酚裂解酶将底物酪氨酸转化为中间体，随后 L-氨基酸脱氢酶和 α-酮酸脱羧酶对其进行加工和脱羧，醛还原酶将醛类中间体转化为醇类目标物质，最后葡萄糖脱氢酶再生反应所需的辅酶 NADH，确保催化过程的连续性和高效性。这 5 种酶的编码基因引入大肠杆菌，并利用高效表达系统实现协同作用，成功构建了羟基酪醇合成途径。实验结果显示，经过基因改造后的大肠杆菌可以将酪氨酸类底物转化为羟基酪醇，且合成的产物与标准羟基酪醇一致，为后续产量提升优化奠定了基础。

在成功构建羟基酪醇合成途径后，研究团队进一步探索如何通过优化酶的表达比例来提升产量。为此，他们设计了多种质粒组合，通过调整每种酶的基因在大肠杆菌内的拷贝数来平衡酶的表达水平。经过多轮测试，发现组和为 pRSF-KAD-aadL/pET-TPL-yahK/pACYC-gdh 的菌株 4 表现出最高的羟基酪醇产量。这种组合的优势在于，高拷贝质粒强过表达 KAD 和 aadL，中拷贝质粒中度过表达 TPL 和 yahK，而低拷贝质粒则满足了 gdh 的表达需求，同时避免了过量表达导致的细胞代谢负担。实验结果表明，与最初的菌株相比，菌株 4 的羟基酪醇产量提升了 84%，显著提高了整体生产效率。

图 | 展示了通过工程化大肠杆菌进行全细胞生物转化以及各菌株中相关酶的活性（来源：上述论文）

为了进一步提高羟基酪醇的产量，研究团队对反应条件进行了优化。他们发现pH 和温度对酶活性有显著影响。实验结果显示，在 pH 5.5 至 7.5 的范围内，羟基酪醇的产量随着 pH 的增加而提高，而当 pH 超过 7.5 后，产量逐渐下降。最终确定最优 pH 为 7.5。温度的优化实验确定，25℃ 是最佳反应温度，在优化后的反应条件下，羟基酪醇的产进一步提高了 89.3%，为后续大规模生产提供了精确的操作参数。

随后研究团队将目光转向工业化生产中常见的规模化挑战。他们设计了一种分批补料的生物转化策略，通过控制底物浓度和反应条件，进一步提高羟基酪醇的生产效率。在 5 L 反应器中进料儿茶酚、丙酮酸和氯化铵进行补料分批生物转化，补料频率包括不补料、每隔 8 小时、4 小时和 2 小时补料，确保儿茶酚浓度始终维持在 40 mM。结果显示，补料频率显著影响最终产量：未补料时产量为 30.8 mM，而每隔 2 小时补料的方案将产量提升至 55.3 mM，较未补料情况提高 1.8 倍。这表明频繁补料可维持儿茶酚的最佳浓度，避免过量抑制酶活性或底物不足，确保了反应的高效进行。该策略为羟基酪醇的工业化生产提供了重要保障。

值得注意的是，先前已报道了许多羟基酪醇的生物合成方法，以酪氨酸为底物可生产浓度为 1.3 mM、1.7 mM、8.1 mM 和 12.3 mM 的羟基酪醇；以酪醇为底物可生产浓度为 10.4 mM、16 mM 和 24.9 mM 的羟基酪醇。由于羟化酶活性低，以酪氨酸和酪醇为底物时羟基酪醇的产率较低，难以满足工业化生产的要求；也有报道利用左旋多巴为底物，通过重组大肠杆菌合成羟基酪醇，但左旋多巴价格较贵，且高 pH 会引起底物分解；另外，之前也已经有研究利用级联生物催化方法，将木质素衍生的儿茶酚和酚转化为羟基酪醇，从 30 mM 儿茶酚和苯酚获得了最大滴度 20.6 mM 和 18.5 mM。

这项研究中羟基酪醇的产量明显高于以前的研究，不仅解决了传统羟基酪醇生产方法成本高、污染大的问题，更突显了生物制造技术在健康与环保领域的巨大应用前景。

1.Xiong, T., Li, X., Liu, W. et al. Multienzyme cascade for synthesis of hydroxytyrosol via engineered Escherichia coli. Sci Rep 15, 471 (2025). https://doi.org/10.1038/s41598-024-84624-5

2.http://sky.xynu.edu.cn/info/1013/6912.htm

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