荷塘月色现身冷冻电镜！颜宁团队再取进展

尽管最近在蛋白质的结构测定和预测方面取得了突破，但碳水化合物的结构研究仍然是一个挑战。

2024年12月31日，清华大学/深圳医学科学院颜宁团队在PNAS在线发表题为“CryoSeek II: Cryo-EM analysis of glycofibrils from freshwater reveals well-structured glycans coating linear tetrapeptide repeats”的研究论文，该研究报告了在清华荷塘淡水中发现的一种糖纤维的冷冻电镜分析。研究人员将其命名为TLP-4，它是由一条四肽重复序列的线性链构成的，上面包裹着一层厚达40nm的聚糖。

在每次重复中，两个聚糖与3,4-二羟基脯氨酸O键相连，另一个聚糖与相邻的丝氨酸或苏氨酸相连。原纤维的结构完全通过聚糖填充来维持。生物信息学分析证实了TLP-4重复序列在物种间的保守性，表明存在大量有待发现的糖原纤维。该研究不仅为聚糖在生物组装中的结构作用提供了有价值的见解，而且还展示了我们最近制定的CryoSeek研究策略在寻找生物实体和建立碳水化合物结构研究原型方面的潜力。

另外，2024年10月9日，清华大学颜宁及李张强共同通讯在PNAS在线发表题为“CryoSeek: A strategy for bioentity discovery using cryoelectron microscopy”的研究论文，该研究采用冷冻电子显微镜（cryo-EM）对清华荷塘的过滤水样进行了分析，报告了两个高度相似的螺旋原纤维的结构测定和表征，命名为TLP-1a和TLP-1b，每个直径约8 nm，宽15-Å。这些原纤维由类似的蛋白质原聚体组装而成，其结构在CryNet中方便地自动建模。原体结构与任何现有的实验结构都不匹配，但与许多未知功能的预测结构具有相同的折叠。原聚体n+4的氨基末端β链插入到原聚体n的裂缝中，完成免疫球蛋白（Ig）样结构域。这种包装机制，被称为供体-链交换（DSE），已经在几种细菌菌毛组装中观察到，其中供体是原聚体n+1。尽管形状和厚度不同，但这种相似性表明TLP-1a/b原纤维可能代表未表征的细菌毛。该研究体现了结构生物学中新兴的范式，其中高分辨率结构先于并指导先前未知物体的识别和功能表征（点击阅读）。

碳水化合物是四种基本有机生物分子之一。它们是重要的能量来源和结构成分，在蛋白质折叠、细胞识别和免疫反应等许多生物过程中起着至关重要的作用。低聚糖或多糖形式的碳水化合物，为了简单起见，研究人员将其统称为聚糖，可以与蛋白质或脂质共价结合，形成称为糖缀合物的结构。单糖的种类和化学结构、分支模式和链长度的显著复杂性导致了糖缀合物的结构和功能的多样性，同时也给结构测定带来了巨大的挑战。由于缺乏关于聚糖的结构信息，从而阻碍了对聚糖的功能和作用机制的全面认识。

单分子成像技术的最新进展使直接阐明聚糖的键和结构成为可能。然而，这些方法通常不能捕获原生状态下的糖缀合物。虽然冷冻电镜（cryo-EM）等结构方法有时可以帮助解析聚糖结构，但它们通常只能为修饰位点附近的聚糖或由凝集素或特异性抗体等糖结合蛋白稳定的聚糖提供适度的分辨率细节。尽管基于人工智能的结构预测已经彻底改变了蛋白质的结构生物学，但缺乏聚糖结构数据阻碍了对聚糖结构的准确预测。

在最近的一项研究中，研究人员在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的原生masgonsemi的完整结构中发现了许多阿拉伯聚糖。这些结构良好的聚糖与羟脯氨酸（Hyp）残基相连，并在mastigoneme组装中发挥重要作用。本研究强调了采用合适的方法和选择合适的研究目标对准确测定聚糖结构的重要性。根据这一思路，研究人员将冷冻电镜作为一种发现工具，并提出了一种名为CryoSeek的研究策略。

根据CryoSeek的工作流程，从淡水中发现厚聚糖包被的线性多肽（图源自PNAS）

利用CryoSeek对从清华荷塘采集的水样进行分析，在原始电子显微照片中观察到大量不同长度和宽度的原纤维。尽管颗粒不均匀且数量有限，但研究人员成功地确定了两种相关原纤维的结构，命名为TLP-1a和TLP-1b。通过CryoNet自动建模和生物信息学分析，研究人员对TLP-1a/b的组装机制和可能的起源有了深入的了解。CryoSeek举例说明了结构引导发现未表征生物实体的新兴范例，这也可能有助于识别适合聚糖结构分析的系统。在TLP-1a/b成功的基础上，研究人员继续努力确定其他原纤维的结构。

该研究报告了3.3 Å分辨率的糖原纤维的冷冻电镜分析。出乎意料的是，冷冻电镜重建显示，这个8纳米宽的纤维中唯一的蛋白质片段是中心的一个由四肽组成的线性肽链。因此，研究人员将其命名为TLP-4。四肽重复序列的线性链上覆盖着一层厚厚的、组装良好的糖壳。在每个重复中，鉴定出三个聚糖，两个与保守的二羟基脯氨酸（diHyp）相连，一个与丝氨酸或苏氨酸相连。紧密排列的聚糖决定了原纤维的整体结构。总之，研究证明了CryoSeek在确定合适的模型系统以表征聚糖结构方面的巨大潜力。

参考消息：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2423943122