动物行为与光电专题（45）丨光纤技术记录钙信号

《动物模型构建与行为学评估》电子版pdf，网盘发货

《动物模型构建与行为学评估》V1.0共计约540页， 主要围绕生物医学领域中动物实验的核心方法，详细介绍了如何通过构建动物模型来研究疾病机理，并且使用行为学评估手段验证这些模型的有效性。书中的内容适用于研究人员在进行神经科学、药理学、生物医学等领域的实验时，理解和运用动物模型这一重要工具。

选用病毒为rAAV-CaMK Ⅱ a-Gcamp6m-WPRE-pA,其同时携带表达在海马及大脑皮层兴奋性神经元的启动子CaMK Ⅱ a和钙离子荧光探针Gcamp6m。Gcamp6m是单个绿色荧光蛋白（GFP)/钙调蛋白（CaM）和平滑肌肌球蛋白轻链激酶片段M13融合的产物，神经元细胞内钙离子浓度升高会引起GFP生色基团环境改变，从而使GCaMP6m的荧光强度（F）增加，增加的荧光强度反应了升高的神经元活性。

将小鼠麻醉，用剃毛器剔除头部毛发；将麻醉后小鼠的头部固定于小鼠头部立体定位仪，在手术显微镜下消毒并减掉颅顶部皮肤，暴露颅骨，清除颅骨表面的结缔组织。根据小鼠脑图谱，查找待记录脑区坐标值。本实验选取的记录位置为外侧眶额皮层区域(Bregma前方2500μm，旁开1500μm)，通过微操纵器进行定位，并在颅骨上做标记点，以标记点处为中心，用电钻轻轻将标记点处颅骨磨薄至一薄层骨片，打磨范围直径约1000μm，显微镊轻轻拨除骨片。光纤陶瓷插芯的制作，光纤切割刀将直径为230μm的裸纤切割成末端平整的长度为13mm的小段，用无水乙醇清洗后将切好的光纤小段插入内径为230μm的SC型陶瓷插芯（数值孔径0.37）中，从陶瓷插芯有凹槽端插入，使其末端刚好伸出陶瓷插芯平面端（<1mm）。一手用镊子夹持陶瓷插芯，另一只手用牙签在凹槽端涂抹混合好的环氧树脂胶。涂抹后的胶呈锥体，高度在0.5mm-1mm间。取干净载玻片，将陶瓷插芯平面端置于载玻片上，在体视镜下观察并做调整使光纤末端与陶瓷插芯的平面端平齐，并小心地将其横向放置在干净的A4纸上。待环氧树脂胶变硬后即可将光纤固定在陶瓷插芯内。为了保证传光效率，必须保证光纤末端和陶瓷插芯末端平齐。

最后在记录位点植入制做好的光纤陶瓷插芯，然后在其周围颅骨上均匀涂抹上C＆B-Metabond使光纤插芯牢固固定在脑内。注意涂抹C&B-Metabond之前要保证脑组织表面不得有血液渗出，颅骨表面不得有结缔组织的存在并保持干燥。术后将小鼠单只笼内饲养。病毒表达以及小鼠身体恢复需2周。

光纤成像记录钙信号

根据光纤记录系统原理，可将其分为荧光激发系统和荧光收集系统。激光器发出波长为488nm的激发光，经过分光镜反射后，反射光从垂直角度射出。射出的光束经过一个放大10倍的物镜（数值孔径0.3）后被聚焦到光纤跳线的纤芯端面上。光纤跳线通过陶瓷插芯连接器与动物头部固定的光纤陶瓷插芯连接，激发光经过光纤跳线和小鼠头部陶瓷插芯后到达特定脑区，从而激发绿色荧光信号。被激发的荧光信号的强度可以被植入动物脑内的光纤末端收集，反向沿着光纤跳线和物镜传播，到达并直接穿过分光镜，经过GFP带通滤波片后，荧光强度信号即可由光电倍增管检测到。

在光纤记录之前给予小鼠36小时禁水处理，记录当天将盛有10%浓度糖水的装置置于鼠笼内让其识别糖水装置，之后将光纤跳线的陶瓷插芯连接器插到小鼠头部固定的光纤陶瓷插芯上。将小鼠置于实验箱内适应10-15分钟，放入糖水装置，在小鼠识别糖水并饮用的过程中同时进行神经元钙信号的记录。每次放入糖水装置时，仅允许小鼠饮用3-5秒便立即取出，以保持小鼠对糖水较长时间的敏感性。每次实验间隔15秒。

数据采集与分析

包括行为学视频以及钙信号的采集与分析。行为学视频采集与分析：应用neural motive采集摄像头及记录软件进行采集，采样频率为50HZ。对离线视频逐帧进行分析，将小鼠舔水的时间记录下来用于在钙信号数据上做时间标记。

钙信号的采集与分析：光电倍增管探测到小鼠脑区内发射的荧光信号后将其转换成电流信号，电流信号经过与光电倍增管配套的放大器后变成模拟电压信号，模拟电压信号进一步经过一个低通滤波器（40Hz）并输入到数据采集系统。以200-500Hz的采样频率记录保存。

光纤记录的结果读入Matlab。然后截取小鼠舔水行为发起之前5秒和舔水后10秒这一时间窗内的荧光强度变化的数据并使其按照舔水行为发起时间为时间零点对应整齐。作者用当前荧光强度F和基线荧光强度F0的差值再除以基线荧光强度F0的值即△F/F=(F-F0)/F0的值来表征上述时间窗内小鼠舔水这一行为前后的荧光强度变化。基线荧光强度F0的选取为小鼠舔水行为发起之前第5秒至第2秒这一时间段的荧光信号强度。分析的结果用两种图表征：一种是热度图，另外一种是事件相关的线图。在热度图中，按照小鼠开始舔水时间作为零点对齐，将所有次数的实验结果按顺序排列呈现。不同的颜色表征实验结果的幅度值大小。作者通常用暖色调表征较高的荧光强度变化，冷色调表征较低的或者反向的荧光强度变化。事件相关的线图描述的是所有次数实验结果的平均值。

光纤成像记录系统及实验装置

光纤成像记录到与小鼠饮水行为相关的神经元反应，将小鼠饮水行为发起的时间作为时间零点，取零点前5秒至后10秒的时间窗，将各个试次按照时间零点对应整齐，不同的颜色代表神经元反应的强弱，其中暖色调代表较强的反应，冷色调代表抑制的或较弱的反应。在小鼠饮水行为发起的时间周围神经元的反应是明显升高的，且各个试次对应整齐。可以反映每次实验的细节信息。小鼠的神经元活性开始升高的时间位点并非是在开始舔水的瞬间，而是在靠近盛水的器皿时或者说有了要舔水的冲动时神经元活性即开始升高，在小鼠舔到糖水的瞬间（时间零点），神经元的活性达到峰值。基于光纤成像具有抗干扰，长时程记录等性能，可成功记录到自由活动的小鼠眶额皮层中与奖赏相关的神经元的活性，这是传统电生理等技术所不能实现的。

注意事项

实验之前，实验人员对小鼠的禁水处理、环境适应处理及糖水装置识别训练是至关重要的一个环节。忽略任何一个细节都可能导致实验的失败。在实验过程中，糖水装置在实验箱中放置的时间不宜过长以使小鼠不能长时间饮水从而使其保持相对饥渴的状态，以保证实验顺利进行。

参考文献

1、Identity-Specific Reward Representations in Orbitofrontal Cortex Are Modulated by Selective Devaluation[J]. James D. Howard;;Thorsten Kahnt.Journal of Neuroscience,2017(10)

2、Improved deep two-photon calcium imaging in vivo[J]. Antje Birkner;;Carsten H. Tischbirek;;Arthur Konnerth.Cell Calcium,2016

3、刘敏,孙晓红,杨子成,等.光纤成像技术记录小鼠眶额皮层奖赏相关神经元活性的应用[J].现代生物医学进展,2019,19(08):1420-1424.

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