《食品科学》：中国农业大学程楠副教授等：食品中麸质及其生物传感检测方法研究进展

面粉是中国人生活中必不可少的食材之一，人们通常会根据要制作面食的需求选择不同筋度的面粉。面粉的筋度与小麦中面筋蛋白的含量相关，而面筋蛋白又被称作“麸质”。麸质蛋白主要包括醇溶蛋白与麦谷蛋白，它们富含脯氨酸和谷氨酸，主要存在于小麦、大麦、黑麦等谷物及其制品中。 全球1%～2%人口受麸质相关过敏症状困扰，其中10%的麸质敏感患者患有乳糜泻（CD）。CD的治疗十分艰难，其唯一确定有效的治疗方法是终身遵循严格的无麸质饮食（GFD）。

中国农业大学食品科学与营养工程学院的张轶然、刘轶斐、程楠*等对食品中麸质生物传感检测方法的最新研究进展进行了综述，以期为之后麸质快速检测方法的研究提供参考。

1

食品中的麸质

1.1 食品中麸质的分布

麸质并非某种特定的化学物质，而是小麦、黑麦和大麦中的储存蛋白。根据在水中的溶解度差异，谷物蛋白可被分为水溶性蛋白和非水溶性蛋白，麸质即为非水溶性蛋白，包括醇溶蛋白与谷蛋白，通常占谷物蛋白的80%左右。麸质敏感相关的醇溶蛋白根据其在酸性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）中迁移率不同，被分成α、β、γ、ω等多种类型，而谷蛋白根据其在SDS-PAGE中迁移率不同可被分为高分子质量谷蛋白以及低分子质量谷蛋白，它们因含有丰富的脯氨酸（P）和谷氨酰胺（Q）而难以被CD患者消化，因此需要对其进行检测。小麦来源中麸质敏感相关过敏原及其对应抗原表位如表1所示。

明尼苏达大学营养协调中心（NCC）食品和营养数据库中的一项调查显示，超过半数的日常食品中可以检测出麸质蛋白，含麸质的谷物制品占全部谷物制品的56.4%，含麸质果蔬制品也能占到全部果蔬制品的14.1%，而在甜点中，这一比值甚至可以高至85.4%。各类食品中含麸质食品数量及百分比见表2。

1.2 CD成因

CD是一种自身免疫性疾病，除了腹泻、呕吐、腹泻、腹痛、腹胀、体质量下降等症状，目前研究表明CD还会使骨质流失的发病率提高50%、慢性肾病的发病率提升500%，甚至与不孕不育等症状也有关联。

CD的病因与人类白细胞抗原（HLA）-DQ2和HLA-DQ8基因有关，携带了这种基因的人群摄入含麸质蛋白的小麦、大麦和黑麦等谷物或其加工食品后，因为麸质蛋白的中心结构域含有富含脯氨酸和谷氨酰胺的七肽PQPQPFP和五肽PQQPY，导致蛋白质不能被患者的肠道完全被消化，未完全消化的谷蛋白肽通过肠道上皮进入前壁，然后通过跨细胞途径或旁途径运输到固有层，导致炎症的发生。细胞在炎症条件下向细胞外基质分泌活化的谷氨酰胺转胺酶（TG）2（也称为组织谷氨酰胺转胺蛋白酶），TG2会使谷蛋白肽中的谷氨酰胺残基脱酰胺，从而提高其与抗原提呈细胞的HLA-DQ2或HLA-DQ8凹槽结合的效率。TG2还会与麸质蛋白形成TG2-谷蛋白复合物，激活B细胞并产生自身抗体。B细胞还可以内化TG2-谷蛋白复合物，释放与HLA-DQ2或HLA-DQ8结合的脱酰胺谷蛋白肽，进一步激活麸质特异性T细胞。白细胞介素-15等促炎细胞因子会激活上皮内淋巴细胞的细胞毒性，通过自然杀伤细胞受体与肠上皮细胞的相互作用导致组织破坏和肠道萎缩。

2

麸质的一般检测

2.1 无麸质食品检测标准

无麸质产品是麸质敏感人群维持健康生活的刚需产品，其原材料主要是燕麦、大米、高粱、荞麦等谷物，玉米淀粉、大米淀粉、高粱淀粉等淀粉，栗子粉、南瓜粉、奇亚籽粉等植物粉。无麸质食物市场报告给出的统计与预测数据显示，2021年全球与中国无麸质食物市场规模已达到810.91亿元。预测2021—2027年，全球无麸质食物市场将以12.5%的复合年增长率增长，预测至2027年，全球无麸质食物市场总规模将会达到1 643.65亿 元。在此情境下，对更加方便快捷的食品中麸质检测方法的需求也越发急切。

根据联合国粮食与农业组织的食品法典标准118—1979中的建议，“无麸质食品”含有的麸质成分含量不应该超过20 mg/kg。根据这一建议，世界各国对食品中麸质的含量进行了立法。在欧盟、美国、加拿大以及巴西，无麸质食品中的麸质限量为20 mg/kg；而在日本以及墨西哥，无麸质食品中麸质成分含量应不高于10 mg/kg；新西兰与澳大利亚对无麸质食品的规定更加严格，只有“未检出”麸质的食品才可以贴上无麸质的标签；而在中国，GB/T 23779—2009《预包装食品中的致敏原成分》中规定了无麸质食品中麸质的含量不应超过20 mg/kg。

2.2 麸质的一般检测方法

目前，中国对食品过敏原检测的国家标准仅有3 项。其中，GB/T 38163—2019《常见过敏蛋白的测定液相色谱-串联质谱法》中使用液相色谱-质谱串联法检测含小麦的饼干制品中麸质含量，此方法检测给定的麸质特征肽，若存在其他致敏的肽，麸质的检出就不完全。而在农业部1485号公告—18—2010《转基因生物及其产品食用安全检测外源蛋白质过敏性生物学分析方法》中，利用生物信息学的方法将待测蛋白质的氨基酸序列与已知过敏原蛋白的序列进行比对，若存在8个连续相同的氨基酸，则认为该蛋白质有致敏的风险，但这些方法对麸质检测都没有很好的适用性。

传统的检测方法对麸质的适用性不强且耗时长、设备昂贵、需要精密的仪器和专业的人员等，生物传感器因其在食品安全检测和监测、环境监测、临床分析和医学诊断等不同类型分析物中的作用而被广泛研究，针对食品中麸质检测的生物传感器也在研究中（表3）。

3

麸质检测生物传感器识别原理

麸质检测中，识别的靶标是麸质敏感相关过敏原对应的抗原表位，识别元件是针对这些抗原表位的抗体、引物以及适配体。在麸质的检测中应用最为广泛的识别技术是基于抗原抗体的识别，麸质检测中使用的每种抗体都是针对某种麸质蛋白或麸质蛋白类型产生的。例如针对热稳定ω-醇溶蛋白的单克隆抗体402/21、针对黑麦醇溶蛋白的单克隆抗体R5、针对α-醇溶蛋白的单克隆抗体G12和针对小麦蛋白的Morinaga抗醇溶蛋白多克隆抗体，它们被广泛应用于麸质的ELISA。其中最常用的抗体为单克隆抗体Skerrit、R5以及G12。目前常见基于免疫识别检测麸质的试剂盒见表4。

尽管基于免疫学的麸质检测方法简单、方便、相对廉价且应用广泛，但因抗体类型、麸质提取程序等多种因素对提取出的麸质蛋白含量具有显著影响，进一步导致不同检测产品对同种受测物质的含量检测具有差异，而DNA不受表型变异性的影响并且具有很高的热稳定性，因此常使用针对产生麸质蛋白的DNA检测对结果进行补充。目前比较成熟的方法有PCR与real-time PCR。除此之外，环介导等温技术（LAMP）也陆续被应用于麸质的检测。可用的引物如表5所示。

此外，由于提取食品中麸质的溶剂大多为60%乙醇溶液，乙醇的蛋白质变性作用会对实验结果造成影响，因此，适配体等非蛋白质受体将有助于改进麸质检测方法。

适配体是从随机序列库中通过迭代选择过程获得的寡核苷酸受体，通过严格高效的配体指数富集系统进化或体外选择，通过构象变化、杂交或独特的化学键合，表现出特定的识别和催化活性，达到亲和配体结合和催化的功能。常用的两种麸质适配体Gli1、Gli4的序列见表6。

4

麸质检测生物传感器

4.1 比色传感器

比色传感器既可以通过颜色的变化实现定性检测，也可以通过对其光度的测定实现对产物的定量检测。目前基于比色法的研究都是关于尺寸、成本以及检测程序的小型化方面，比色传感器中，因为添加物使体系出现可以通过肉眼观察到的颜色变化，其对分析仪器的依赖比较低而且不需要价格昂贵的大型仪器。比色传感器因其简单的制作步骤、灵敏快速的检测以及低廉的成本成为快速检测食品中麸质含量的最佳选择，因此在食品麸质的快速检测中，比色传感器是最常见的。用于检验食品中麸质的比色传感器可以根据其显色原理分为两类：基于贵金属纳米粒子局域表面等离子共振效应的比色传感器以及基于TMB显色反应的比色传感器，如图2所示。

AuNPs具有依赖于尺寸的光学特性，会根据其大小、形状和聚集状态显示不同的颜色。此外，金属纳米颗粒尺寸在2～20 nm的范围内，与蛋白质或DNA等生物分子的尺寸相当，赋予了这两类材料的结构兼容性，因此它们适用于各种检测方式和技术。在食品中麸质的比色检测中，AuNPs被应用在各种场合中，最常见的应用就是作为ELISA以及侧向流动分析中的信号元件，指示麸质的存在与否。Hnasko等使用AuNPs标记的二抗作为信号元件构建了检测食品中麸质的侧向流动免疫分析传感器，可以检测复杂食品基质中低至150 ng/mL的麸质蛋白；Masiri等将AuNPs作为信号元件，依托自表达的新型抗麸质单克隆抗体构建了侧向流动分析方法，可以检测到食品中低至2 mg/kg的脱胺麸质。

TMB分子式为C 16 H 20 N 2 ，是一种安全的显色试剂，显色稳定且灵敏。作为氢供体，TMB可以被氧化为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺苯二胺，使原本的无色溶液变为蓝色。辣根过氧化酶（HRP）是一种常用于TMB显色反应中的过氧化物酶，在HRP的作用下，TMB可以被H 2 O 2 氧化为蓝色的oxTMB，这一显色反应是最常应用于麸质比色传感中的反应之一。

4.2 荧光传感器

荧光是分子中电子从激发态跃迁到基态过程中的发光现象。当某些物质被特定波长的光照射时，由于在极短时间内发射出波长更长的光，物质的荧光特性可能会与其他物质反应后发生改变，根据这种变化可以构建出用于物质检测的荧光传感器。

荧光传感器由于能够将设备微型化、进行实时分析和快速执行，且具有无放射性、操作简单、高通量、高灵敏度和样本量小等优点，被越来越多地应用于定量过敏原检测。此外，由于许多放大机制被用来提高荧光方法的信噪比以及灵敏度（图3A），因此荧光传感器相对于比色传感器的灵敏度提高了2～3 个数量级。

荧光传感器在食品麸质的检测中应用广泛，Huang Chao等研制了一种基于新型水溶性环金属化Ir络合物的发光开关探针，可在多种干扰元素存在的情况下灵敏、特异地检测麸质蛋白，检出限为2.6 μg/mL；Pla等基于麸质适配子和纳米孔阳极氧化铝载体的协同组合，使用荧光染料罗丹明B作为信号输出原件，构建的比色传感器检出限为100 μg/kg（图3B）；Bonilla等使用抗体-量子点复合体构建了检测面团中麸质蛋白的免疫荧光传感器，克服和消除了面团自发荧光对检测结果的干扰。

4.3 电化学传感器

电化学法是根据物质在溶液中的电学和电化学性质进行分析的方法。利用电流、电位、电阻、电势等物理量，在给予一定电压或电流的情况下对溶液内在关系进行分析。在各种类型的传感器中，电化学传感器具有连续实时分析、简单、高特异度和灵敏度、经济实惠、响应速率快、体积相对紧凑和操作方便等优点，且电化学传感器有各种各样的外形，从顶层工作台到完全集成的可穿戴设备等，因此，电化学传感器被广泛应用于麸质的高灵敏检测中（图4）。

恒电位安培法是最常用于检测食品中麸质的电化学方法，在工作电极上施加固定的电位，测量氧化还原反应产生的电流，通过循环伏安法和/或线性伏安法等其他电化学技术评估。Lin等开发了一种可检测包括麸质在内的5 种食品中过敏原的便携式检测技术，称为集成外源抗原检测，通过监测体系中电流变化程度实现过敏原的定量检测，对麸质的检测灵敏度为0.1 mg/kg。

电化学阻抗谱同样被应用于食品中麸质的检测，通过测试电极/电解液界面并跟踪电极/溶液界面的阻抗或电容的变化，可以有效检测电极表面与分析物之间的相互作用。Malvano等研制了一种快速、可靠的无标记阻抗适配体传感器，在麸质质量浓度为50～1 000 mg/L范围内呈良好的线性关系。

电位测量技术通过测量或控制电位对食品中麸质含量进行检测。White等建立了一种基于浮栅晶体管结构的电化学可调电位传感器，用于麸质的定量检测，可以检测到低于20 mg/kg的无麸质食品中的小麦和大麦麸质。

电化学细胞传感器是结合电化学检测技术，以细胞作为传感器的识别元件，将细胞固定在电极表面，细胞受到刺激后，经换能器将电极检测到的细胞生理信号转变成电信号，以此进行检测。Jiang Donglei等研制了一种基于三维生物打印的仿生“肠微绒毛”电化学细胞传感器，该传感器可以特异、准确地检测小麦醇溶蛋白，检出限为0.036 ng/mL。

5

结 语

作为影响全球1%人口的食品过敏现象，以CD为代表的麸质敏感症状正在受到更多人的重视，对市面上无麸质食品中麸质含量的检测需求也不断提升。然而现有的液相色谱-质谱联用等方法需要价格高昂的仪器和受过训练的专业人员，无法满足快速便携、操作简便的需求，目前生物传感器的研发使检测步骤得到了大大简化，然而大部分检测方法中麸质提取需要使用高浓度的乙醇，不利于传感器在消费者群体中的推广使用。基于此目标，未来食品中麸质检测的传感器应该具有以下特点：1）更简便、快速的前处理流程；2）无毒无害的麸质提取与检测介质；3）便携、智能、易懂的信号输出设备。

本文《食品中麸质及其生物传感检测方法研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷13期292-299页. 作者：张轶然，刘轶斐，孙宛舒，张宸，周秀芝，刘清亮，罗云波，黄昆仑，程楠. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230723-257. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网