科学家揭示核斑点在RNA中的角色，​为探索核斑点转录组提供工具

日前，武汉大学博士毕业生、目前正在美国芝加哥大学从事博士后研究的吴晋军，和所在团队通过使用 ARTR-seq 这一转录组测序技术，让研究核斑点功能和 RNA 定位测定向前迈出了一步，也为揭示核斑点在 RNA 剪接中的作用做出了一定贡献。

研究中，吴晋军系统性地探讨了核斑点的功能，并揭示了其在 RNA 剪接以及其他相关生物过程中的角色。针对与核斑点相关的疾病机制，本次研究提供了新的视角和理论基础。

相比 APEX（engineered ascorbate peroxidase）和 TSA-seq（tyramide signal amplification sequencing）等传统方法，吴晋军等人使用的 ARTR-seq 方法具有更高的精确度，在转录物定位分析上有着显著突破。

当针对 ARTR-seq（reverse transcription–based RNA binding protein binding sites sequencing）方法加以扩展之后，还能更好地研究靶向核斑点的转录组。

此前已有研究表明，核斑点与癌症以及神经性疾病存在密切关联。而通过应用这一方法，可以识别与特定癌症相关的核斑点转录组的变化，从而助力于揭示新的癌症标志物。

此外，对于阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症等神经系统疾病患者来说，当针对他们的核斑点加以研究，就能发现其与正常人在 RNA 剪接和核斑点定位上的差异，从而助力于通过干预 RNA 剪接来治疗神经疾病。

同时，ARTR-seq 方法有望成为研究无膜细胞器功能的通用型工具。它能有效捕获与抗体锚定点相邻的转录物，因此可以通过更换靶向抗体，来研究核仁、P 小体（P body）、卡哈尔体（Cajal body）等其他细胞器的功能。

总的来说，对于无膜细胞器的深入研究，将增强人们对于细胞功能、疾病机制和生物技术应用的理解。

据吴晋军介绍，在真核细胞中，无膜细胞器是一种普遍的存在。并且，无膜细胞器会广泛地参与基因表达、信号转导和应激反应、核糖核蛋白复合体的加工与组装。

核斑点，则是高等真核细胞核内最重要的无膜细胞器之一，它里面含有许多剪接体成分或剪接调节因子。

核斑点的组成或形态变化，常常与癌症、感染以及神经系统疾病相关。然而，人们对于核斑点的基本功能尚未明确，因此很难深入理解这些疾病的发病机制以及核斑点在其中的作用。

目前，关于核斑点的研究仍存在若干未解决的问题，主要包括：

首先，是否所有基因都依赖核斑点进行共转录或转录后剪接？这一问题会涉及到核斑点的普遍性和必要性。

其次，如果并非所有基因都依赖核斑点，那么哪些转录物会利用核斑点进行剪接？这些转录物具有什么特征？这一问题则与不同类型转录物在核斑点中的作用和机制密切相关。

费静怡教授，是吴晋军目前在芝加哥大学的合作导师。前者在博士后期间便开始研究核斑点的结构和功能。

在独立建组之后，她希望进一步探索核斑点的生物学意义，并与对此同样感兴趣的美国纽约大学奥德·雷格夫（Oded Regev）教授开展合作。

确定研究方向之后，他们发现针对核斑点这种无膜亚结构中的 RNA，现有转录组测序技术往往存在检测精度不足的问题。尤其在采用 APEX-seq 方法的时候，其在 RNA 捕获的精确性上存在一定局限性。

因此，该课题组决定采用芝加哥大学何川教授团队的 ARTR-seq 技术。

ARTR-seq 原本用于检测与 RNA 结合蛋白的相互作用，而吴晋军等人在此基础之上加以创新应用，以核斑点标记蛋白 SON 和 SRRM2 为靶标，通过结合抗体来精确地捕获核斑点附近的 RNA，从而为核斑点的转录组探索提供了更细致的工具。

在实验分析和数据分析上，吴晋军和同事进行了多次优化，尤其在负对照的选择上做了细致的考量。

具体来说，他们对比了两种负对照方法：

一种是使用 ARTR-seq 方法但不含一抗的样本数据集进行标准化，从而消除 ARTR-seq 中的潜在序列偏差，获得更精确的富集值估算。

另一种是采用标准核 RNA-seq，这与 ARTR-seq 没有关系，但却能反映每种 RNA 在核中的丰度。

通过分别使用这两种方法，以及运用 RNA FISH（Fluorescence in situ Hybridization）成像等多种检测手段验证其效果，吴晋军发现第一种方法在成像结果与富集值的高度相关性上表现优异，而第二种方法则表现得较为逊色。

在确立分析方法后，他们首先深入挖掘了测序数据，将 INSE（nuclear speckle enrichment index）分为 INSE（intron）和 INSE（exon）, 以便借此评估总转录本（INSE（exon））与未被剪切的 RNA（INSE（intron））在核斑体的富集情况。

为了进一步探讨转录本的剪接状态，他们使用了剪接抑制剂 Pladienolide B，并在处理前后对数据进行对比。

并根据转录本在核斑体的富集情况，将基因分为三组：

A 组，转录本在正常条件下富集于核斑体；

B 组，在剪接抑制条件下富集；

C 组，完全不富集。

通过将分类的基因与其他发表数据对比，课题组得到了 A、B、C 组基因之间的区别：A 组和 B 组基因离核斑体更近，A 组的未剪接转录本更倾向于聚集在核斑体内部，B 组的转录本则在核斑体表面富集。

接下来，他们针对分析结果进行实验验证，并利用 RNA/DNA FISH 实验确认了这一分类结果，进一步验证了不同组基因在核斑体的定位特征。

同时，该团队通过敲除 SON 和 SRRM2 的方式，以及通过过表达 CLK1 的方式，来破坏核斑体的结构。

结果表明：核斑体能够显著促进 A 组和 B 组基因的剪接，而 C 组基因的剪接则不会受到影响。

同时，他们还研究了热应激之下核斑点的作用，结果发现核斑点可以通过调控内含子滞留来调控基因的选择性表达。

为了探讨核斑体对基因剪接的选择性调控，该团队还构建了一款回归模型，借此揭示了与核斑体定位相关的 RNA 序列特征。

分析结果显示：

A 组基因具有较高的 GC 含量、短内含子和较弱的剪切位点；B 组基因的转录本同样具有较高的 GC 含量、短内含子，但展现出更强的剪接相关序列，同时拥有较高的剪接效率。

在论文中，针对 ARTR-seq 在揭示核斑体中 RNA 不同富集模式的应用，以及针对 ARTR-seq 与剪接调控关联的应用，课题组进行了相关阐述，从而为理解核斑体在基因表达和疾病机制中的作用提供了新视角。

日前，相关论文以《RNA 定位到核斑的动态与剪接效率有关》（Dynamic of RNA localization to nuclear speckles are connected to splicing efficiency）为题发在Science Advances[1]。

吴晋军、肖雨、刘云筝是共同第一作者，费静怡和奥德·雷格夫（Oded Regev）担任共同通讯作者。

未来，他们将进一步地测试不同序列特征如何决定 RNA 的核斑体定位，以便全面验证序列依赖性。

通过使用高通量筛选和定量成像技术，其将验证不同 RNA 序列和剪接增强子在核斑体中的定位特性，借此将能建立更加详细的序列定位规则，从而用于研究核斑体对 RNA 的选择机制。

此外，他们将针对疾病进行探索，鉴于核斑体定位对基因表达的调控作用，其将探索该机制在遗传性疾病中的应用潜力。

特别是在涉及剪接变异的疾病，比如在某些癌症和肌营养不良症中的应用，通过此他们希望探索这些序列特征对于细胞活动的影响，以及探索它们在不同疾病模型中的作用。

参考资料：

1.Wu, J., Xiao, Y., Liu, Y., Wen, L., Jin, C., Liu, S., ... & Fei, J. (2024). Dynamics of RNA localization to nuclear speckles are connected to splicing efficiency.Science Advances, 10(42), eadp7727.

排版：刘雅坤、何晨龙