科海撷珠 | “医”欲善其事，必先利其“酶”

体检时的抽血、新冠疫情期间的核酸检测、流感暴发时的抗原检测帮助我们快速、准确地确诊疾病，从而使患者及时接受治疗。这些检测的背后少不了酶的神奇作用，因此，对酶的创新研发重要性不言而喻。

体外诊断是我们日常就医中常用的检测方法，是指将血液、体液、组织等标本从人体中取出，使用体外检测试剂、试剂盒或仪器等对标本进行检测与校验。70%以上的医疗决策都源于体外诊断，因此，体外诊断又被称为医生的“眼睛”，对疾病的防控和治疗具有不可替代的重要意义。

对体外诊断来说，酶是其核心反应体系中不可或缺的成分。酶是由活细胞产生的、存在于生物体内的一种生物催化剂。每一种生物在生命过程中，从小到大，繁衍生息，生老病死，新陈代谢，都和酶有关，可以说没有酶也就没有生命。早在4 000多年前，我国古代人民就开始利用大麦芽中的酶制造饴糖，利用发酵法酿酒、制醋，但那时人们并不知道酶为何物。后来，随着人们对酶的认识的不断加深，酶学、酶工程、酶的应用不断迈向新的纪元。

一直以来，体外诊断核心酶产品研制多源自欧美发达国家，我国诊断试剂中的核心酶原料严重依赖进口，导致检测成本居高不下。

蛋白酶K：重压之下突破国外垄断

2020年新冠疫情暴发期间，以蛋白酶K为代表的核心原材料被美国政府列为战略防控物资，造成了对我国的供货中断，严重影响了新冠核酸诊断试剂的生产。因此，诊断酶制剂国产化及应用成为我国突破国外垄断和限制的迫切需求。

新冠病毒核酸提取过程主要包括裂解和纯化两大步骤：首先是裂解，即破坏样品细胞结构，从而使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程；然后是纯化，即使核酸与裂解体系中的其他成分，如蛋白质、盐及其他杂质彻底分离，这一反应过程需要蛋白酶K的参与。蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，在病毒核酸检测中，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放，完成核酸抽提。

多年来，上海交通大学生命科学技术学院教授冯雁团队致力于攻破以蛋白酶K为代表的诊断核心酶产品国产化关键技术，发展了酶分子进化工程技术体系，形成了诊断酶尤其是新冠病毒诊断酶制备工艺提升、生物检测应用等重要成果，极大缩短了蛋白酶K性能改造的研发周期，酶活力和稳定性达到国际先进水平，成本较传统技术降低了50%，以稳高产实现了3个月国产诊断酶规模化替代国外产品的“中国速度”。

Argonaute核酸酶：可编程的核酸快检

核酸检测在传染性疾病诊疗中发挥着重要作用, 目前对高灵敏度、快速、居家检测的需求尤为迫切，以解决专业人员短缺、检测结果等候时间长和检测可靠性低等问题。

近年来，以CRISPR为代表的基因编辑酶（Cas12/13）核酸检测技术，解决了核酸检测中的假阳性、可视化等问题，被誉为“下一代分子诊断技术”。然而，该体系存在RNA引导链合成昂贵且易降解、多重检测反应体系复杂等诸多问题，限制了其临床应用。冯雁团队利用高温菌Argonaute（简称Ago）基因编辑酶的级联剪切机制，结合快速等温扩增，建立了新型多重快速核酸检测平台技术——MULAN，实现了新冠及流感病毒样本的高灵敏度、高特异性、快速的便携式检测。

Ago是一种靶向剪切DNA的基因编辑酶，它采用短DNA引导链对互补靶标链进行特异性剪切。冯雁团队发现Ago具有级联剪切活性，即在初始DNA引导链指导下的剪切产物可进一步指导互补单链DNA的剪切。研究人员先对病毒DNA进行扩增，然后利用Ago的特点，先设计两条与扩增产物互补的DNA引导链，Ago在这两条引导链的帮助下定位并进行初次剪切，得到剪切产物。接下来，研究人员还要设计一条与剪切产物互补的荧光信标DNA，其上标记着荧光基团。此时，之前得到的剪切产物摇身一变成为新的引导链，在其引导下，Ago对荧光信标DNA进行次级剪切，从而释放荧光信号，显示检测结果。

随后，研究人员以3种不同的传染病病毒为检测对象，设计3组不同的特异性DNA引导链，实现了单酶对多病毒的精准识别。

与现有的检测技术相比，MULAN具有快速、准确、经济的优势，尤其是多重检测的简便性和安全性优于目前报道的CRISPR检测技术，且对PCR仪等昂贵仪器设备依赖较低。

酶是生物体内的自然法宝，冯雁团队数十年如一日地雕琢这件法宝，对其充分利用、不断开发，把诊断酶的制备工艺牢牢掌握在中国人自己手中，使体外诊断变得更加高效、经济。这不仅对传染病诊疗产生积极影响，也将对重大疾病防控提供理论和技术支撑。

本文相关成果“以蛋白酶K为代表的诊断核心酶产品自主创制与国产化关键技术”荣获2022年度上海市技术发明奖一等奖。

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