Nature Cell Biol | 蛋白相态转换调控新机制：张秀任团队揭示相分离驱动RNA修饰与miRNA生成的双向调控

责编 | 王一

蛋白的固有无序区（Intrinsically disordered region, IDR）可介导分子间/分子内多价的弱相互作用，驱动蛋白形成的凝聚体。蛋白凝聚体根据物理特征，可以分为流动性依次减弱的的液态，胶态和固态。值得注意的是，蛋白凝聚体具备“相转变”能力，能够自发转换物理状态，例如如由液态“变硬”为胶状或固态，从而激活或抑制其功能。为了应对无序蛋白这种不稳定的物理状态，细胞演化出了复杂的调控机制。一方面，细胞利用分子伴侣来维持蛋白质的特定物理状态；另一方面，通过蛋白酶体等降解途径清除由于蛋白错误折叠产生的非活性凝聚体【1】。

在细胞内，RNA分子的生成，加工和翻译受到一系列精密的机制调控，任何调控环节的微小偏差都可能引发细胞功能异常, 甚至导致疾病。其中，两个至关重要的RNA调控相关蛋白复合物-RNA m6A甲基转移酶复合物 (Methyltransferase complex, MTC) 和微处理器复合物 (Microprocessor) - 在RNA调控网络中扮演着核心角色。MTC负责催化RNA的m6A修饰，这一表观转录修饰在RNA代谢和功能调控中起着关键作用。近期研究揭示，在拟南芥中，MTC的关键因子MTA (MTC subunit A) 能够与隐花色素CRY2共同发生液-液相分离，从而根据光照条件调节昼夜节律相关基因的m6A修饰水平【2】。然而，基于MTC的另一个关键组分MTB (MTC subunit B) 的相变控制机制仍有待阐明。微处理器复合物负责切割microRNA前体底物（pri-miRNA）生成成熟的microRNA。值得注意的是,清华大学戚益军教授课题组在之前的研究中报导了该复合物的核心成员SERRATE (SE) 也具有液-液相分离的能力。这种相分离现象能够提高微处理器复合物对pri-miRNA的加工效率，并促进miRNA双链向RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex,RISC) 的转运【3】。这两种复合物之间的交叉调控，以及其潜在的分子机制，仍是当前RNA生物学领域的一个重要科学问题。

近日，德州农工大学张秀任教授团队在Nature Cell Biology杂志上发表了题为SERRATE drives phase separation behaviours to regulate m6A modification and miRNA biogenesis的研究论文，揭示了无序蛋白SERRATE介导的相分离现象在RNA m6A甲基化修饰与microRNA生成这两个关键RNA代谢过程之间的相互调控机制。

研究发现，尽管SERRATE和MTB都是无序蛋白，但它们的凝聚体表现出截然不同的物理特性:SERRATE可以通过液-液相分离形成液态凝聚体，MTB则形成不可溶的聚集体。有趣的是，SERRATE可以利用其内在的液-液相分离（LLPS）能力与MTB形成液共凝聚体(图1.a)，从而防止MTB形成不溶性聚集体并增加其溶解性(图1.b-d)。SERRATE和MTB的液态共凝聚体具有流体特征，能够有效吸收环境中的RNA底物,从而增强MTC的催化效率(图1.e)。相比之下,RNA在MTC不溶性聚集体表面的不均匀分布导致较低的转移酶活性。

沉降实验进一步证实,在se突变体中,MTB可溶性降低。蛋白降解实验揭示,这些不可溶的MTB易被20S蛋白酶体降解,而SERRATE和MTB形成的液态共凝聚体则能有效保护蛋白质免受20S蛋白酶体的降解(图1.f)。

图1.SERRARE和MTB形成液态共凝聚体促进蛋白溶解度和稳定性。

a, FRAP分析利用se突变体制备的原生质体中瞬时表达各蛋白组合的流动性。

b-d, 沉降实验的免疫印迹分析(b)及其定量统计结果(MTA为c, MTB为d),揭示se突变体中m6A甲基转移酶复合物(MTC)组分的可溶性显著降低。

e,蛋白和核酸体外共凝聚体实验显示1,6-己二醇（1,6-hexanediol，HD）阻断液态凝聚体形成及降低复合物RNA结合能力。

f, 体外20S蛋白酶体降解实验表明,具有液态物理特性的SERRATE蛋白能够有效保护MTB免受蛋白酶体介导的降解。

研究进一步揭示了MTC在microRNA生物合成过程中的多重调控作用。该复合物通过将以SERRATE为核心蛋白的微处理器复合物招募至染色体上,促进miRNA前体底物(pri-miRNA)共转录加工。此外,m6A甲基化转移酶复合物还在pri-miRNA的侧翼单链区域建立m6A修饰,这一修饰模式为m6A读取蛋白(如ECT2)的识别和结合提供了分子基础(图2.a)。这些m6A读取蛋白能够富集修饰后的pri-miRNA底物,并将其输送至microprocessor复合物,从而促进pri-miRNA在核质的高效加工(图2.b)。MTC突变体中，ECT2蛋白表现出异常的结合模式,倾向于占据pri-miRNA的茎环结构,从而阻碍了正常的加工过程(图2.a,c)。

图2. RNA m6A修饰促进pri-miRNA的生成及本研究提出的调控模型。

a. 凝胶迁移实验揭示RNA m6A读取蛋白ECT2具有弱双链RNA结合能力和强m6A识别能力。

b. 体外微处理器复合物切割实验证实适量ECT2蛋白可促进甲基化pri-miRNA的切割。

c. m6A修饰与miRNA生成机制交叉调控的模型。左上:野生型条件下,MTB可与SE形成液体状共凝聚,维持其溶解性和酶活性。左下:se突变体中,MTB可能发生错误折叠,导致其聚集及降解。右上:MTC可招募微处理器复合物至MIRNA基因,参与pri-miRNA的共转录加工。同时,m6A读取蛋白与甲基化pri-miRNA的侧翼区域及微处理器复合物相互作用,促进加工过程。右下:缺失写入酶导致pri-miRNA共转录加工和甲基化受损。此外,读取蛋白占据pri-miRNA的结构区域,阻碍下游加工事件。

德州农工大学的钟嵩潇助理研究员为第一作者。张秀任教授课题组的李鑫娣博士为研究提供了质粒构建，植物材料准备，原生质体转化等一系列支持；李长昊博士负责生物信息学分析；严星星博士、朱佳莹博士、Taerin Oh博士和李念魁博士在蛋白质纯化和其他材料准备方面提供了重要帮助。此外，该研究得到了其他课题组共同作者的支持。内布拉斯加林肯分校的于彬教授和甘露博士提供了关键的转基因植物材料；德州农工大学Thomas Meek博士和朱霁云博士提供了质谱分析帮助，Hisashi Koiwa博士则提供了显微成像方面的专业技术支持，彭旭教授提供了宝贵的指导和建议。张秀任教授的前实验室成员张钟徽教授（现就职于华南师范大学）团队提供了MTA和MTB蛋白抗体，张钟徽教授为文章的共同通讯作者。

张秀任教授实验室综合运用分子生物学、生物化学、遗传学、组学、计算生物学和人工智能等多种方法，致力于研究植物RNA生物学，包括转录后基因沉默和表观遗传学，并逐步拓展至不同模式生物的广泛应用。此外, 张秀任教授实验室还聚焦于宿主-微生物相互作用研究。实验室近期发表的文章主要涉及以下三个方向

1. 通过遗传和生化筛选,全面研究RNA silencing过程的关键基因和组分(近期代表性论文:Wang et al.,2018, Nature; Ma et al.,2018, Development Cell; Li et al.,2020, Nature Plants; Sun et al.,2021, Science Advance; Wang et al.,2022, Science Advance.; Shang et al.,2023, PNAS)。

2. 探究RNA二级结构和表观转录组中蕴含的遗传密码(近期代表性论文:Zhang et al.,2024, Genome Biology; Yan et al.,2024, Nature Plants; Li et al.,2024, Nature Plants; Zhong et al.,2024, Nature Cell Biology)。

3. 研究表观遗传水平或其他遗传通路上的宿主-微生物相互作用(近期代表性论文:Hu et al.,2019, PLoS Pathogen; Wang et al.,2023, Nature Communication)。

该团队目前经费充足，己开放多个职位，欢迎感兴趣的博士后和研究生申请加入。

参考文献：

1 Alberti, S. H., A. A. Biomolecular condensates at the nexus of cellular stress, protein aggregation disease and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol 22, 196-213 (2021). https://doi.org/10.1038/s41580-020-00326-6

2 Wang, X. et al. A photoregulatory mechanism of the circadian clock in Arabidopsis. Nat Plants 7, 1397-1408 (2021). https://doi.org/10.1038/s41477-021-01002-z

3 Xie, D. et al. Phase separation of SERRATE drives dicing body assembly and promotes miRNA processing in Arabidopsis. Nat Cell Biol 23, 32-39 (2021). https://doi.org/10.1038/s41556-020-00606-5

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41556-024-01530-8