中药单体思路if9+案例: 芍药苷通过MAPK/mTOR信号通路启动自噬，保护肝细胞免受APAP诱导的损伤

题目：芍药苷通过MAPK/mTOR信号通路启动自噬，保护肝细胞免受APAP诱导的损伤

杂志：Cellular & Molecular Biology Letters（IF 9.2）

发表时间：2024.9

研究背景

药物性肝损伤（DILI）正逐渐成为引起急性肝衰竭的全球性普遍问题，尤其是对乙酰氨基酚（APAP）引起的急性肝损害。芍药苷（Paeoniflorin，PF）对多种肝脏疾病具有广泛的治疗作用。然而，在目前的研究中，它们之间的关系仍然很少被研究。该研究旨在探讨PF对APAP诱导的肝损伤的保护作用，并研究其可能的分子机制。

研究思路

C57BL/6J雄性小鼠注射APAP建立DILI模型，并连续5天给予PF治疗。为了阐明PF在APAP诱导的DILI中的药理作用，采用高通量等技术对其分子机制进行了研究。

研究结果

PF可减轻APAP所致肝损伤的病理改变

通过宏观病理检查，观察到注射APAP后，APAP小鼠的体重开始较对照组下降，肝脏指数和脾脏指数均升高。相比之下，高剂量PF和低剂量PF组可以使脾脏和肝脏肿胀降低，说明PF减轻了脾脏和肝脏的肿胀。

与对照组相比，APAP组大鼠血清中肝功指标均显著升高，表明DILI模型建立成功。与APAP组相比，高、中剂量PF显著降低了ALT、ALP、γ-GT、TBIL和AST水平。

此外，病理结果也显示了PF对肝脏具有保护作用，明显减缓了APAP引起的肝损伤的进一步进展。

PF抑制ROS，提高APAP模型小鼠抗氧化能力

为了阐明PF处理对氧化状态的影响，首先评估了氧化相关指标的水平。与对照组相比，经APAP处理后，SOD和GSH的含量显著降低，而PF在不同浓度下，尤其是在200 mg/kg时，恢复了APAP小鼠的抗氧化能力。对于MDA，不同剂量的PF减轻了APAP组的明显升高和氧化效应的发生。这些指标表明，PF减轻了APAP模型氧化应激的发生。

同时，用免疫荧光法观察和测定ROS的表达。与APAP组相比，MPF和HPF组的ROS荧光表达明显受阻，说明高、中剂量PF显著抑制了肝细胞中ROS的表达。APAP组CYP2E1阳性表达水平高于对照组和PF组。APAP组CYP2E1反应明显加重。然而，与APAP组相比，给予100和200 mg/kg剂量的PF明显逆转了APAP刺激的氧化应激。APAP注射后CYP3A4的表达增加，而200 mg/kg剂量的PF明显逆转了这种作用。TEM结果显示，APAP组线粒体结构模糊，脊线不清晰。基质电子密度增大，粗内质网扩大。高剂量PF处理后，线粒体结构完整，基质均匀，电镜下呈均匀的灰色结构。粗面内质网的形态结构得到恢复。这一证据解释了PF阻断ROS的产生，提高细胞色素P450酶的活性，增强小鼠抗APAP损伤的抗氧化能力。

PF抑制APAP诱导的肝损伤中细胞凋亡的进展

与对照组相比，APAP组肝损伤区有大量阳性凋亡因子聚集。此外，与APAP组相比，治疗组细胞凋亡阳性表达率明显降低，提示PF改善了APAP诱导的肝损伤细胞凋亡。为了进一步证实凋亡在PF治疗肝损伤中的作用，采用免疫组化方法检测凋亡特征因子的阳性表达。阳性表达集中在肝门静脉区，且APAP刺激小鼠肝脏中caspase 3的表达更为严重，提示肝损伤过程伴有细胞凋亡。同样，caspase 9在对照组低表达，在APAP组高表达。PF预处理降低了促凋亡蛋白（caspase 9和caspase 3）的阳性表达。Western blotting检测促/抗凋亡蛋白（BAD、BAX、caspase 9、caspase 3和BCL-2）的相对表达量。APAP使结果升高，而PF使结果的相对表达明显降低。

PF激活自噬可保护肝脏免受APAP损伤

相关研究表明，自噬选择性地去除受损的线粒体和NAPQI蛋白加合物，从而阻断APAP引起的肝损伤的进展。用透射电镜观察肝组织中自噬体数量和细胞器结构。与其他各组相比，APAP组粗面内质网广泛肿胀，仅见少量自噬体。同时观察到肝细胞凋亡、核收缩和染色质浓度的变化。相对而言，PF组的自噬体数量明显增强，肝细胞形态结构完整，染色质分布均匀。

利用免疫组化和WB观察自噬调节相关蛋白（LC3和p62）的变化。免疫组化结果显示，PF增加了LC3的阳性表达，对自噬起促进作用。APAP组p62的表达显著增加，而PF处理则减轻了p62的表达。与免疫组化相似，WB对MPF和HPF组p62的表达有明显抑制作用。对于LC3， APAP明显降低了II型与I型的比例， PF有效缓解了这一过程。

此外，免疫荧光结果显示，APAP组荧光弱，MPF和HPF组荧光强。WB结果表明，APAP组与对照组相比，ATG5和ATG7均减少。相反，PF逆转了APAP的作用，促进了它们的表达。作者还测量了mRNA的表达水平，以确定APAP诱导小鼠自噬活性的变化。这些结果表明，PF有效地缓解了APAP引起的自噬抑制。

转录组学揭示了PF在APAP诱导的肝损伤中的深层机制

对小鼠肝脏样本进行了测序，以进一步了解PF对APAP所致肝损伤的潜在机制。与对照组不同，APAP组有2444个基因上调，1552个基因下调。HPF组和APAP组共存在508个不同的基因，其中443个下调，65个上调。结合GO分析和KEGG富集结果，MAPK通路在三组差异基因分析中得分较高。因此，转录组学分析结果表明，MAPK信号通路在PF对APAP药物性肝损伤的活性中发挥了关键作用，从而进一步调节mTOR信号，激活自噬，抑制氧化应激和细胞凋亡。

PF通过直接靶向p38阻断MAPK/mTOR信号通路

为了进一步研究PF在MAPK信号传导中的作用，作者进行了分子对接分析。随后，通过分子动力学模拟研究了PF与p38的结合能力。结果表明p38-PF复合物结合良好。这些结果表明，在MAPK信号级联中，PF可能靶向p38而不是ERK，并且PF与p38的结合是稳定的。

此外，mRNA表达结果与转录组分析一致。PF（200 mg/kg）显著下调MAPK1、MAPK14和mTOR的相对表达。western blotting结果显示，过量注射APAP后，p38和ERK蛋白的磷酸化被显著激活，MPF和HPF有效抑制了这一变化。而对于mTOR的磷酸化，仅在200 mg/kg PF浓度下才有抑制作用。这表明PF作用于MAPK信号，进而调控mTOR的磷酸化。此外，APAP刺激会抑制ULK1的磷酸化，而PF明显逆转了这一作用，恢复了ULK1的磷酸化，进一步激活了下游自噬蛋白。总之，结果表明PF通过阻断MAPK/mTOR信号传导来启动自噬，保护肝细胞。

文章小结

文章结合了生化分析、组织病理学、免疫组化、转录组测序等多种实验方法，全面评估了PF对APAP诱导的肝损伤的影响。PF抑制了APAP诱导的肝损伤的关键过程，从而发挥了恢复作用，其保护作用是通过靶向p38下调MAPK/mTOR信号通路来诱导自噬、抑制细胞凋亡和氧化应激。

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