经典思路1区: 河南中医药大学揭示皂角抗喘息性支气管炎的成分及作用机制

【写在前面】：本期推荐的是由河南中医药大学研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示皂角抗喘息性支气管炎的成分及机制研究。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Gleditsiae Sinensis Fructus ingredients and mechanism in anti-asthmatic bronchitis research

背景：皂角（Gleditsiae Sinensis Fructus，GSF）在传统医学中常用于治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病。然而，关于GSF的化学成分以及治疗支气管哮喘的药理活性物质和作用机制的研究不足。

目的：使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析了GSF的化学成分。本研究结合网络药理学、分子对接技术和实验验证，探索GSF治疗支气管哮喘的疗效及其作用机制。

方法：利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS对GSF的化学成分进行表征。通过数据库筛选活性成分。利用相关数据库检索活性成分和与支气管哮喘疾病相关的靶蛋白，选择两者之间的共同靶点。使用String数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，识别关键靶点。通过Metascape数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。利用Cytoscape构建“成分-共同靶点”网络，识别主要活性成分。使用AutoDock软件进行分子对接验证。

建立卵清蛋白（OVA）诱导的支气管哮喘小鼠模型，测量小鼠肺器官指数。使用HE、PAS和Masson染色观察肺组织病理变化。使用肺功能测试仪器评估小鼠的呼吸阻力（Penh）。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）测定小鼠血清中IgE、IL-4、IL-5和IL-13的水平。进行免疫荧光染色，检测肺组织中AKT和PI3K蛋白的表达水平。进行体外实验，观察油酸（EA）对IL-4刺激的人类气道平滑肌细胞（hASMCs）的影响。使用CCK-8实验测量细胞活性，计算EA的IC50值。进行创伤愈合测试，观察EA对愈合程度的影响。通过RT-qPCR检测EA对细胞中ALB、SRC、TNF-α、AKT1和IL6 mRNA表达水平的影响。

结果：从GSF中鉴定出95个化学成分，其中37个被鉴定为活性成分。活性成分和疾病靶点之间有169个重叠靶点。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的拓扑分析确定了IL6、TNF、ALB、AKT1和SRC为核心靶点。富集分析显示，GSF治疗支气管哮喘主要涉及AGE-RAGE信号通路和PI3K-Akt信号通路等。主要活性成分包括13(s)-HOTRE、亚麻酸和乙酰胆碱。分子对接结果表明，GSF的关键成分与核心靶点之间具有良好的结合活性。动物实验研究表明，GSF有效改善了OVA诱导的哮喘小鼠的症状、肺功能和肺组织病理变化，同时减轻了炎症反应。GSF降低了AKT和PI3K蛋白的荧光强度。EA的IC50值为30.02μg/ml。EA（30）显著促进了IL4-刺激的hASMCs细胞的增殖。EA（30）显著增加了ALB和SRC mRNA的表达，并降低了TNF-α、AKT和IL6 mRNA的表达。

（图文摘要）

【前言】

支气管哮喘的发病率在全球范围内逐年上升。治疗哮喘的主要药物是皮质类固醇和支气管扩张剂。然而，皮质类固醇有许多副作用，导致患者依从性差和疾病复发。长期、慢性的哮喘发作会严重影响患者的肺功能。

中医药（TCM）在治疗支气管哮喘方面具有一定的优势，并且安全性良好。中医药将其归类为“哮喘”或“喘息综合征”，并认为其发病机制是体内痰湿积聚，被外邪因素搅动，阻塞气道，损害肺功能，导致痰湿和气滞交织。《金匮要略》一书中提到：“在咳嗽、逆气、习惯性吐浊痰、不能坐卧的情况下，建议使用皂角丸。”皂角丸主要由皂角（Gleditsiae sinensis fructus，GSF）这种草药组成，以药丸或加入枣泥的煎剂形式给药。在临床实践中，它通常用于治疗慢性阻塞性肺病、支气管扩张、支气管哮喘等肺部疾病。

GSF指的是豆科植物皂角（Gleditsia sinensis Lam.）的干燥成熟果实，具有辛辣、咸、温的性质，轻微毒性。它主要作用于肺和大肠经，具有化痰、开窍、散结、消肿的功能。现代研究发现，GSF的主要成份是皂苷和黄酮类化合物，它们具有化痰、减轻肺部炎症，并具有抗炎和抗过敏作用。

然而，目前关于GSF在治疗支气管哮喘方面的药理基础及其具体疗效和作用机制的研究还不足。因此，在这个实验中，使用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术对GSF的化学成分进行全面分析和鉴定。还使用网络药理学和分子对接技术探索治疗支气管哮喘的药理成分和作用机制。然后进行体内外实验进行验证，为探索GSF在治疗支气管哮喘方面的应用提供理论参考。

【结果部分】

1. GSF的植物化学分析

图1展示了GSF在正离子和负离子模式下的总离子色谱图。通过化合物质谱碎片模式的组合、与文献数据的比较以及与参考标准的验证，共鉴定出95种化合物。这些化合物包括32种黄酮类化合物、21种皂苷、27种有机酸、10种含氮化合物、3种木脂素、1种香豆素和1种其他化合物。

2. 结构分析

3. 预测潜在活性成分和作用机制

潜在靶点的鉴定和分析

在Swiss Target Prediction数据库中对37种化合物进行了筛选，使用"Probability>0"的选择标准来预测它们的靶点。使用关键词"bronchial asthma"，在OMIM、TTD和Drugbank数据库中进行搜索，分别得到了46、5和66个靶点。GeneCards数据库用于筛选相关性评分大于或等于中位数两倍的靶点，得到702个靶点。DisGeNET数据库用于筛选评分值大于或等于中位数两倍的靶点，得到766个靶点。将所有数据库的结果进行整合，去除重复项，共获得了与支气管哮喘相关的1191个靶点。将GSF中的活性成分靶点与支气管哮喘的靶点进行整合，共得到了167个共同靶点（图3A）。

PPI网络分析

在STRING数据库中查询了169个共同靶点，选择"Homo sapiens"作为物种，并将置信度分数阈值设置为>0.4。在这次分析中排除了游离靶点。因此，构建了一个包含169个节点和2480条边的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。该网络中的平均节点度为29.3。在获得靶点之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）关系后，将TSV文件导入Cytoscape 3.8.2。基于它们的度值选择关键靶点，并构建了PPI网络。通过筛选度值大于中位数两倍的靶点，共鉴定出28个核心靶点。其中，排名靠前的蛋白质包括白细胞介素6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、白蛋白（ALB）、蛋白激酶B1（AKT1）和非受体酪氨酸激酶（SRC）（图3B）。

功能分析

将核心靶点进行GO生物过程富集分析和KEGG通路分析，使用Metascape数据库。应用P < 0.05的显著性阈值来筛选结果。共鉴定出864个显著的生物过程，主要涉及激素反应和细胞迁移的正向调节。在细胞组分方面，找到了50个相关术语，重点关注膜筏、膜微域和焦点粘附。此外，还富集了59个分子功能，包括氧化还原酶、蛋白激酶、磷酸转移酶和酒精受体活性。根据P值选择每个类别（BP、CC和MF）的前10条通路，并使用条形图进行可视化（图3C）。

共富集了144条KEGG信号通路，顶级通路包括AGE-RAGE信号通路和PI3K-AKT信号通路。为了可视化这些结果，根据P值选择了前20条信号通路，并使用气泡图表示（图3D）。

C-C-P网络构建

使用Cytoscape 3.8.2构建了一个"成分-共同蛋白"网络（图3E）。根据网络中的度值排名，前10个成分为13(s)-HOTRE、亚麻酸、白桦酸、(15Z)-9,12,13-三羟基-15-十八烯酸、乙酰胆碱、木犀草素、羟基黄酮、地奥司明、芹菜素和油酸。

4. 关键活性成分与核心靶点基因之间的分子对接

根据“成分-共同靶点”网络，基于交叉靶点的度值，选择了前10个关键活性成分。前五个关键靶点被确定为IL6、TNF、ALB、AKT1和SRC。进行了分子对接以评估结合活性，认为结合能量阈值<-5 kcal/mol表明具有良好的结合活性。对接结合能量显示在表3和图4中。结果表明，化合物2、5、6、7、8、9和10与所有五个关键靶点的结合能量都<-5 kcal/mol，表明这些化合物与靶点之间具有良好的结合活性。选择了对接结合能量最低的四个复合物进行可视化。

5. 动物实验的验证

肺功能检测

使用非侵入性肺功能检测仪器（USA）评估了每组小鼠的气道反应性。结果显示，在不同浓度的乙酰胆碱刺激下，模型组小鼠的Penh值比对照组显著增加。相比之下，地塞米松组和GSF（772）、GSF（386）和GSF（193）组的Penh值较模型组显著下降。这种下降在乙酰胆碱浓度为50 mg/mL时最为明显（图5A）。

肺指数

与对照组相比，模型组的肺指数显著增加（P < 0.01）。与模型组相比，地塞米松组以及GSF（772）、GSF（386）和GSF（193）组的肺指数显著降低（P < 0.01）（图5B）。

肺组织病理学

H&E染色结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的肺泡壁轻度增厚，支气管上皮层显著增厚，气道狭窄，粘膜下和支气管周围壁广泛浸润炎症细胞，气道平滑肌肥大。与模型组相比，地塞米松组、GSF（772）、GSF（386）和GSF（193）组在肺组织中的炎症细胞浸润显著减少，支气管平滑肌增厚减少。改善程度与剂量增加成正比。PAS染色结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的杯状细胞显著增生，粘液分泌增加。然而，与模型组相比，地塞米松组、GSF（772）、GSF（386）和GSF（193）组的杯状细胞增生显著改善，粘液分泌减少。Masson染色结果表明，与对照组相比，模型组的胶原蛋白沉积显著增加。相比之下，与模型组相比，地塞米松组、GSF（772）、GSF（386）和GSF（193）组的胶原蛋白沉积显著减少（图5C）。

酶联免疫吸附测定

与对照组相比，模型组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-5和IL-13的表达水平显著增加（P < 0.01, P < 0.05）。相比之下，与模型组相比，地塞米松组、GSF（772）、GSF（386）和GSF（193）组小鼠血清中IgE、IL-4、IL-5和IL-13的水平显著降低（P < 0.01, P < 0.05）（图5D–G）。

6. 免疫荧光

免疫荧光结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中支气管周围的AKT和PI3K蛋白的荧光强度显著增加（P<0.01）。与模型组相比，地塞米松组、GSF（772）组和GSF（386）组的AKT蛋白的荧光强度均显著降低（P<0.01）。GSF（193）组的AKT蛋白的荧光强度有所降低（P<0.05）。与模型组相比，地塞米松组、GSF（772）组、GSF（386）组和GSF（193）组的PI3K蛋白的荧光强度均显著降低（P<0.01）（图6A-D）。

7.体外细胞实验

CCK-8实验

由于分子对接结果表明油酸（EA）是皂角的主要活性成分，因此选择EA进行体外实验验证。在制备细胞炎症模型后，用含有不同浓度EA（5、10、20、40、80和160 μg/ml）的培养基处理细胞。使用CCK-8实验评估细胞活性。结果表明，EA的IC50值为30.02 μg/ml（图7A）。

创伤愈合实验

根据IC50值，使用三种剂量的EA，即EA（15）（15 μg/ml）、EA（30）（30 μg/ml）和EA（60）（60 μg/ml）进行创伤愈合实验，以观察它们对IL4刺激的hASMCs的影响。结果表明，EA（15）和EA（30）显著促进了IL4刺激的hASMCs细胞的增殖（P < 0.01）。其中，EA（30）的效果强于EA（15）（图7B-C）。

定量实时PCR

根据PCR结果，与对照组相比，模型组的ALB mRNA表达显著降低（P < 0.01）。与模型组相比，EA(30)和EA(60)显著增加了ALB mRNA的表达（P < 0.01）。与空白组相比，模型组的SRC mRNA表达显著降低（P < 0.01）。与模型组相比，EA(30)显著增加了SRC mRNA的表达（P < 0.01），而EA(15)增加了SRC mRNA的表达（P < 0.05）。此外，与空白组相比，模型组的TNF-α mRNA表达显著增加（P < 0.01）。与模型组相比，EA(30)和EA(60)显著降低了TNF-α mRNA的表达（P < 0.01）。与空白组相比，模型组的AKT mRNA表达显著增加（P < 0.01）。与模型组相比，EA(30)和EA(60)显著降低了AKT mRNA的表达（P < 0.01）。与空白组相比，模型组的IL6 mRNA表达显著增加（P < 0.01）。与模型组相比，EA(30)和EA(60)显著降低了IL6 mRNA的表达（P < 0.01）（图7D–H）。

【结论与讨论】

皂角含有丰富的药理活性成分，但对其化学基础的研究还不够充分。通过UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术，我们从皂角中鉴定出了94种化合物，包括32种黄酮类化合物、20种皂苷、27种有机酸、10种含氮化合物、3种木脂素、1种香豆素和1种其他化合物。这些发现突出了皂角的主要活性成分是黄酮类化合物、皂苷和有机酸。

在支气管哮喘的治疗中，中医药通过调节免疫平衡和抑制炎症因子的释放来发挥作用。研究发现，皂角提取物能够调节炎症因子水平和AGE-RAGE信号通路，对慢性支气管炎小鼠模型具有治疗效果。AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中也起着重要作用，该通路的激活与多种炎症反应有关。PI3K-Akt信号通路是细胞内一个重要的信号传导途径，涉及细胞存活、增殖、代谢等多个过程。在哮喘治疗中，PI3K-Akt信号通路的调节可能对减轻气道炎症和气道高反应性有积极作用。此外，PI3K-Akt信号通路还与其他信号通路如MAPK/ERK、NF-κB、Wnt/β-catenin和JAK/STAT等存在交互影响，共同参与细胞生理和病理过程的调控。

在对GSF的主要活性成分和支气管哮喘核心靶点的分子对接研究中，发现亚油酸、乙酰胆碱、木犀草素、羟基黄酮、地奥司明、芹菜素和油酸等与IL6、TNF、ALB、AKT1和SRC等核心靶点具有较强的结合亲和力。这些成分可能通过调节PI3K-Akt信号通路和抑制炎症水平来发挥对支气管哮喘的治疗效果。

此外，免疫荧光实验结果表明，GSF能够降低AKT和PI3K蛋白的荧光强度，表明GSF可能通过影响这些信号通路来发挥作用。研究还发现，GSF的主要活性成分EA对气道平滑肌细胞（hASMCs）有促进增殖的作用，并且能够调节相关基因的表达，如增加ALB和SRC mRNA的表达，降低TNF-α、AKT和IL6 mRNA的表达。

综上所述，GSF通过其多种活性成分，可能对支气管哮喘具有潜在的治疗作用，这些作用可能通过调节关键的信号通路和靶点来实现。这些发现为GSF作为哮喘治疗药物的研究提供了新的视角和科学依据。

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