陈凯等人利用LNP递送Cas9 RNP，实现肺和肝脏的高效基因编辑

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术具有巨大潜力，如果能够开发出安全且有效的递送方法，CRISPR疗法将为遗传疾病提供广泛的治疗。目前，病毒载体是进行体内CRISPR基因编辑的最常用的递送载体，但病毒载体 可能具有免疫原性，还存在病毒基因组整合风险，并且由于持续表达基因编辑器，可能导致脱靶DNA损伤。 如果能够克服有效性和毒性方面的问题，那么非病毒载体替代策略可能解决上述局限，为CRISPR基因编辑器的递送提供新选择。

脂质纳米颗粒（LNP） 是目前最常用的非病毒递送载体，LNP递送mRNA在肝脏的基因编辑方面已经取得了显著成功。然而，LNP向非肝脏组织递送mRNA仍然存在挑战，LNP递送CRISPR mRNA和sgRNA面临着sgRNA不稳定、mRNA介导的Toll样受体（TLR）激活以及编码基因编辑器的大片段mRNA翻译效率低下等问题，这些问题是mRNA固有的，但可以通过开发新型LNP递送载体来减轻。

以核糖核蛋白（RNP）复合物的形式直接递送基因组编辑器，即Cas9蛋白+sgRNA，可能解决基于mRNA和基于病毒递送载体的CRISPR编辑器递送相关的几个局限。特别是，由于RNP的细胞内半衰期较短，预计其引起的TLR活化水平低于mRNA，并产生最小的脱靶DNA损伤。此外，RNP可能提供比mRNA更高的体内编辑效率，因为它避免了大片段mRNA的原位翻译，并通过高亲和力的Cas9结合提供了对sgRNA的天然保护。因此，基于LNP的RNP递送策略具有巨大的转化潜力，然而，RNP缺乏用于有效LNP包裹所需的负电荷密度。而且，制备LNP的条件通常包括可以使蛋白质变性的有机溶剂。此外，虽然LNP递送RNP形式的SpCas9在肝脏中实现了基因编辑，但向肺等非肝脏器官的递送效率仍然不高。

2024年10月16日，加州大学伯克利分校Jennifer Doudna教授 、Niren Murthy教授团队（陈凯、Hesong Han为共同第一作者）合作，在 Nature 子刊Nature Biotechnology上发表了题为：Lung and liver editing by lipid nanoparticle delivery of a stable CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein 的研究论文 【1】 。

该研究开发了一种用于在体外和体内进行CRISPR基因编辑的通用平台，该平台基于工程改造的热稳定性的iGeoCas9基因编辑酶以及新开发的LNP配方，能够将基因编辑器以RNP形式高效封装、递送和组织特异性基因编辑。LNP递送的iGeoCas9 RNP可能为体内基因编辑疗法的开发提供了新方法。

陈凯

陈凯，本科和硕士毕业于浙江大学化学系，2015年加入加州理工学院Frances Arnold教授（2018年诺贝尔化学奖得主）实验室读博，目前在加州大学伯克利分校Jennifer Doudna教授（2020年诺贝尔化学奖得主）实验室进行博士后研究。

研究团队认为，目前限制基于LNP的RNP递送的蛋白质变性问题可以使用耐高温的CRISPR酶替代来解决。与SpCas9或LbCas12a等常用的基因编辑器相比，来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的GeoCas9的Cas9 RNP具有更高的热稳定性和更高的负电荷密度，在LNP介导的递送中具有巨大的潜力。然而，GeoCas9的基因组编辑效率较低，并且需要较大的PAM序列，使其无法编辑大部分基因组位点。

在这项最新研究中，研究团队展示了实验室进化的GeoCas9突变体——iGeoCas9可以在体外以高于野生型GeoCas9的100倍以上的效率编辑哺乳动物细胞，并且在通过LNP进行递送后，可以有效地编辑细胞和动物器官。

基于LNP的平台，其中含有pH敏感的PEG化脂质和阳离子脂质，其递送的iGeoCas9对小鼠神经祖细胞（NPC）、人胚肾293T细胞（HEK293T）和人支气管上皮细胞（HBE）的编辑效率从4%到99%不等（视编辑位点而定）。

这些iGeoCas9 RNP-LNP在与细胞中的单链DNA（ssDNA）模板递送输送时，还能诱导同源重组修复（HDR），并在一次静脉注射后高效地编辑小鼠肝脏和肺部。例如，iGeoCas9 RNP-LNP配方中含有可降解离子化脂质，在Ai9小鼠的整个肝脏组织中平均编辑了37%的组织，在野生型小鼠的整个肝脏组织中也以31%的效率编辑了PCSK9基因，与使用其他递送系统时观察到的编辑水平相当。此外，iGeoCas9 RNP-LNP配方含有可生物降解的可电离脂质，在Ai9小鼠的整个肺组织中平均编辑了16%的细胞，并且在肺部以19%的效率编辑了引起肺纤维化疾病的 SFTPC 基因，与之前使用的基于病毒或非病毒递送载体的基因组编辑相比，这是一个重大改进，凸显了iGeoCas9 RNP-LNP作为当前基于病毒或非病毒载体的递送策略的替代方案的潜力。

总的来说，这项研究表明，热稳定性的基因编辑器iGeoCas9与优化的LNP结合，可以在体外和体内进行高效基因编辑，是开发CRISPR疗法的一个有前景的平台。

2024年8月23日，加州大学伯克利分校Niren Murthy、Hesong Han，加州大学戴维斯分校王爱军等人在Nature Nanotechnology期刊发表了题为：Acid-degradable lipid nanoparticles enhance the delivery of mRNA 的研究论文 【2】 。

该研究开发了一种名为“azido-acetal”（叠氮基-缩醛）的可酸降解连接子，利用其合成了由PEG化脂质、阴离子脂质和阳离子脂质组成的可降解脂质，并以此为基础合成了在内体中快速水解的LNP （RD-LNP） 。在体外和体内实验中，RD-LNP显著提高了LNP-mRNA复合物的性能，相比传统LNP更有效地将mRNA递送到小鼠的肝脏、肺、脾脏和大脑中，以及体外的造血干/祖细胞中。

这项研究表明，在体内调节LNP的降解速率具有极大潜力，可进一步扩大LNP在医学领域的应用。

论文链接：

1. https://www.nature.com/articles/s41587-024-02437-3

2. https://www.nature.com/articles/s41565-024-01765-4