柑橘黄龙病诊断技术研究最新进展

柑橘黄龙病诊断技术研究最新进展

王全兴等

基金项目：国家自然科学基金项目（31160358）和江西省科技厅管理科学类项目（20234BAA10W062）

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是柑橘生产上的毁灭性病害，系国内外检疫对象，在亚洲、非洲、大洋洲、美洲近 50 个国家和地区，以及我国广东、广西、福建、海南、台湾、江西、湖南、浙江、贵州、云南、四川等 11 个省区均有发生 。柑橘黄龙病病原为韧皮部杆菌属（CandidatusLiberibacter）中的 3 种细菌，即亚洲种（Ca. L. asiaticus, CLas）、非洲种（Ca. L. africanus, CLaf）和美洲种（Ca. L. americanus, CLam），我国的柑橘黄龙病菌均为韧皮部杆菌属亚洲种 [2] 。柑橘黄龙病在田间主要通过柑橘木虱传播，带病苗木和接穗调运则是其远距离传播的主要途径。防控柑橘黄龙病最主要的措施之一是及时砍除病株减少侵染源，但其前提条件是需对病株进行准确诊断。黄龙病的诊断技术不断发展进步，包括田间诊断、指示植物鉴定、碘-淀粉显色、电镜显微镜观察、血清学反应、一系列分子检测及光谱分析。本文将对国内外柑橘黄龙病诊断技术进行综述，以期为黄龙病准确、灵敏、快速诊断提供有益参考。

1 田间诊断

田间诊断，也称现场诊断或症状诊断。柑橘黄龙病发生后，病株表现枝梢黄化，严重时全株黄化，树体衰退死亡。当年发病的春梢叶片可正常转绿，但很快表现出斑驳状黄化，夏秋梢抽出后一般不能正常转绿，表现黄化症状，或其枝梢上部叶片黄化，中下部叶片出现黄绿相间的斑驳。上述病叶从秋末开始陆续脱落，翌春从病梢上萌生纤细枝条，叶片窄小，叶肉变黄，叶脉及其附近仍绿，类似缺锌症状。柑橘黄龙病斑驳型病叶具有不对称黄化、多于叶片基部和叶脉附近黄化及颜色鲜黄等独特症状，是田间诊断黄龙病最可靠的依据 。通过近十多年来对柑橘黄龙病进行的多批次 PCR检测，发现在表现不对称黄化的柑橘斑驳病叶中均检测到柑橘黄龙病菌 。柑橘黄龙病除在叶片表现症状外，在果实上也表现较特异症状，如在橘类上出现“红鼻果”、在橙类上出现不易着色和着色不均的“青果”，在蜜柚上果实拉长畸形 ，但这些症状均不如斑驳病叶具有特异性，这在田间诊断时需慎重把握。

2 指示植物鉴定

国外鉴定柑橘黄龙病的指示植物通常用伏令夏橙（Valencia）、奥兰多橘柚（Orlando tangelo）等，我国一般用椪柑 。对症状不明显的可疑黄龙病病株，可取其枝条嫁接到健康椪柑苗上，其后置于 28~32 ℃环境中使其发病。若为黄龙病株，2—3 个月后在嫁接的椪柑苗上会出现黄龙病特征性状，长则需要6—10 个月甚至更久 。指示植物鉴定法比田间诊断可靠，但鉴定周期长，不适用于快速检测。

3 碘-淀粉显色检测

黄龙病可以导致柑橘树筛管崩塌堵塞，影响树体养分的正常运输，导致叶片出现异常高的淀粉积累。根据柑橘黄龙病叶片富含淀粉遇碘变蓝和健叶淀粉含量少遇碘变色不明显的特性，开发出碘-淀粉显色的柑橘黄龙病检测技术。初期的碘-淀粉显色检测技术是对叶片的研磨液染色或直接对叶片组织进行染色，根据颜色变化判断植株是否感染了黄龙病。鉴于健叶也含有一定的淀粉而被不同程度染色，以及叶片中的叶绿素对染色发生干扰，毛润乾等 将待测叶片在碘液染色前进行黑暗、冷冻和脱色处理，降低了叶片残留淀粉和叶绿素的影响，显著提高了该技术对柑橘黄龙病的诊断准确性。王许会等 进一步对柑橘黄龙病碘-淀粉法快速检测技术进行优化，通过磨掉叶片正反面表面蜡质层，直接脱色，可以省去冷冻处理步骤，且显著缩短脱色时间。王春梅等 利用碘-淀粉显色技术对田间采集的大量柑橘黄龙病疑似症状病叶进行检测，并用常规 PCR 进行验证，结果表明碘-淀粉显色诊断黄龙病的准确率达 93.9%，出现假阳性的为柑橘裂皮病和天牛为害样品，它们在碘-淀粉检测中也呈蓝黑色。因此，利用碘-淀粉显色技术进行柑橘黄龙病样品检测时，需结合田间症状进行判断，并在此基础上再进行 PCR 确诊。

4 电子显微镜观察

20 世纪 70 年代开始使用电子显微镜进行柑橘黄龙病诊断，步骤为取柑橘黄龙病叶片叶脉制作超薄切片后置于电子显微镜内进行观察，如果在叶脉的筛管细胞内观察到圆形或长圆形、大小为 50~600 nm×170~1 600 nm、具有明显细胞壁的细菌菌体，可对黄龙病进行正确的诊断 。柑橘黄龙病菌在树体内含量较低且分布不均，以及电镜检测费用较高，因此电镜检测在柑橘黄龙病诊断中不常使用 。

5 血清学检测

柑橘黄龙病菌寄生于植株韧皮部内且含量低，不能人工培养，导致抗血清制备难度较大。柯穗等 和李德望等 分别用柑橘黄龙病菌提纯液免疫小鼠，成功制备出黄龙病菌小鼠抗腹水，但前者制备的抗腹水效价较低，并存在非特异性反应，后者制备的抗腹水虽然效价较高，特异性强，但检测灵敏度不高，不能检测带菌无症叶片，不适于黄龙病的早期诊断。Garnier 等 制备了中国福建、印度和南非柑橘黄龙病原的多个单克隆抗体，但这些抗体专一性过强，检测时容易出现假阴性，造成漏检。因此，柑橘黄龙病血清学检测在实践中应用很少。

6 DNA 探针检测

以目标 DNA 特异序列为模板，人工合成带有放射性同位素或生物素标记的单链 DNA 片段，即DNA 探针，利用 DNA 探针与待测 DNA 序列进行互补结合，产生杂交信号，从而实现对目标 DNA的检测。Villechanoux 等 以印度黄龙病菌序列为模板，制备了 2 个32 P 标记的同位素探针 In-2.6 和In-1.9，这两个探针均能特异性检测柑橘黄龙病菌亚洲种。Planet 等制备了32 P 标记的同位素探针As-1.7，能特异性检测柑橘黄龙病菌非洲种。Hocquellet 等 制备了地高辛（DIG）标记的非放射性探针 In1.7-DIG 和 As1.7-DIG，分别能特异性检测柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种。国内开展 DNA 探针检测柑橘黄龙病的研究不多。DNA 探针检测既准确，灵敏度也高，但受检测费用高、操作复杂等因素影响，在实践中应用较少。

7 PCR 技术检测

PCR 技术是 20 世纪 80 年代发展起来的一种体外核酸扩增技术，具有准确、灵敏、快速、简便等优点，广泛应用于病害诊断、基因工程等领域。基于不同的目的要求，发展出多种类型的 PCR，其中常规 PCR、巢式 PCR 和实时荧光定量 PCR 在柑橘黄龙病菌检测中应用较多。

7.1 常规 PCR 检测

Jagoueix 等 根据柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种 16S rDNA 序列设计特异性引物 OI1/OI2c 并进行 PCR，能从这两种菌中扩增出大小 1 167 bp 的特异性片段，将此片段用限制性内切酶 XbaⅠ酶切，根据酶切片段数的不同，可以区分黄龙病菌亚洲种和非洲种。Teixeira 等 设计引物 GB1/GB3，能特异性扩增柑橘黄龙病菌美洲种，扩增片段大小 1 027 bp。Hocquellet 等 根据柑橘黄龙病菌亚洲种和非洲种 β 操纵子基因序列设计引物 A2/J5，用该引物可从亚洲种中扩增出大小 703 bp 的片段，从非洲种中扩增出大小 650 bp 的片段，因此，根据扩增片段大小即可确定是柑橘黄龙病菌亚洲种还是非洲种。A2/J5 是目前国内外柑橘黄龙病菌检测常用引物之一，多年来，用该引物对江西柑橘黄龙病菌进行检测，结果表明该引物特异性强，扩增时杂带少，检测结果明确可靠 。

7.2 巢式 PCR 检测

对待扩增的目的片段设计两对引物，即外引物和内引物，先用外引物对目的片段进行第一轮 PCR扩增，随后以扩增产物为模板用内引物进行第二轮 PCR 扩增，此即巢式 PCR（Nested PCR）。国内外众多学者对柑橘黄龙病菌开展了巢式 PCR 检测，结果表明与常规 PCR 相比，其检测特异性更强，灵敏度更高。在李韬等 柑橘黄龙病检测试验中，巢式 PCR 检测灵敏度比常规 PCR 高出 10~100 倍，巢式 PCR 能检测单头带菌木虱和未显症植株，但常规 PCR 只能检测低至 2 头带菌木虱，且难以检测未显症带菌植株。

7.3 实时荧光定量 PCR 检测

实时荧光定量 PCR 技术（quantitative real-time PCR, qPCR）是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，通过对荧光信号的定量分析，实现对 DNA 或 RNA的定量检测。与常规 PCR 相比，qPCR 具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高等优点，被广泛应用于柑橘黄龙病菌的定量检测。Park 等 对美国德克萨斯和佛罗里达的柑橘黄龙病菌进行 qPCR 检测，表明病根检测的灵敏度比病叶检测的灵敏度更高，利用 qPCR 对根部黄龙病菌检测即可实现显症前诊断，有利于及早防控黄龙病的发生。罗小玲等 [25] 利用 qPCR 对广东德庆县贡柑和广佛手同时进行黄龙病菌检测，结果表明同一时期染病广佛手同一部位的 CLas 浓度普遍比染病贡柑低，表明广佛手对黄龙病有更强的抗性。

8 环介导等温扩增技术检测

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是日本学者 Notomi 于 2000年发明的一种新型核酸扩增技术。该技术针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异性引物，依靠链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温（60~65 ℃）条件下进行基因扩增，在不到 1 h 内可将DNA 拷贝扩增至 10 9 数量级。该技术不依赖 PCR 仪，只需一个水浴锅控制温度就能完成核酸扩增，同时在反应体系中添加指示物质，通过目测颜色变化就能判断扩增结果，因此它是一种简便、快速、廉价的基因扩增方法，并具有灵敏度高、特异性强的优点。利用 LAMP 技术检测柑橘黄龙病菌在国外有大量报道，国内报道则较少。Agarwal 等研究表明，采用 LAMP 技术能在田间快速、高效检测出柑橘木虱体内的黄龙病菌。Choi 等 对柑橘黄龙病叶片进行 LAMP 检测，发现其检测灵敏度是常规 PCR 的 10 倍，虽然其检测灵敏度不如 qPCR，但无需使用 PCR 仪，也省去电泳步骤。国内黄丽等 开展了柑橘黄龙病菌 LAMP 检测，表明其检测结果准确，灵敏度与 qPCR 相当，是常规 PCR的 100 倍，特别适合黄龙病田间样品快速检测。

9 纳米孔测序技术检测

纳米孔测序技术（nanopore sequencing）是近年来发展起来的第三代测序技术。该技术将具有微孔的蛋白质如 α-溶血素嵌入磷脂双层膜中形成纳米孔（1~2 nm）通道，测序时，先将待测序的双链DNA 或 RNA 变性成单链分子，然后让单链 DNA 或 RNA 分子通过纳米孔通道，纳米孔通道在被核酸通过时其电流发生变化并被电子设备检测和转换为 DNA 或 RNA 的碱基序列信息。纳米孔测序具有超长读长、实时、快速的优点，但存在价格较高、检测准确度较低等不足。目前，纳米孔测序已广泛应用于基因组测序、动植物病原体检测等领域 。近年来，卢慧林等将纳米孔测序技术引入柑橘黄龙病菌检测中，虽然获得了可靠的检测结果，但发现病样中柑橘黄龙病菌 DNA 含量通常较低，其测序结果受到高含量植物基因组 DNA 的影响，导致纳米孔测序技术尚未在黄龙病菌检测中广泛应用。

10 高光谱成像技术检测

高光谱成像技术（hyperspectral imaging，HSI），也即高分辨率光谱成像技术，是 20 世纪末发展起来的一种集图像学和光谱学于一体的新技术。该技术利用高光谱成像仪对待测样品进行扫描，获取高光谱分辨率的连续、窄波段的图像数据，对样品实现快速、准确和无损检测。与传统成像技术相比，高光谱成像技术具有光谱分辨率高、波段多且连续以及采集到的图像信息量丰富、识别度高等优势，在植物病害诊断等领域展现出广阔的应用潜力。近年来，一些学者开展了柑橘黄龙病菌高光谱成像技术检测。梅慧兰等 采用高光谱成像技术，结合偏最小二乘判别分析，实现了对柑橘黄龙病的早期、快速、无损检测及不同病情分级；Wang 等通过高光谱建模分析，可将脐橙健康叶片与感染未显症叶片区分开来，达到了对脐橙黄龙病叶片成功进行早期无损检测的目的。

11 结 语

柑橘黄龙病传染性强，危害大，目前尚缺乏有效的治疗药剂，只能通过砍除病株来阻止病害的进一步传播，因此，及时准确诊断黄龙病对其有效防控至关重要。在黄龙病的研究进程中，出现了上述多种检测技术，但在实际工作中应用最广的还是田间诊断和 PCR 技术。在进行柑橘黄龙病田间诊断时，一定要掌握斑驳型叶片不对称黄化特点，这是田间诊断黄龙病最可靠的依据；在遇到斑驳型症状特征不明显或表现其他黄龙病可疑症状时，可通过常规 PCR 技术进行分子检测；如需对未显症植株进行早期黄龙病检测，则需因地制宜地选用灵敏度更高的 qPCR、巢式 PCR 或 LAMP 等技术。纳米孔测序和高光谱成像检测技术代表当今植物病原物检测新技术，但目前技术还欠成熟，随着其技术不断发展成熟，未来很可能在柑橘黄龙病诊断中发挥重要作用。