《食品科学》：中国水产科学研究院杨敏副教授等：褐藻胶寡糖的酶法定向制备及其结构-功能关系的研究进展

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（M）及其C5-差向异构体α-L-古罗糖醛酸（G）通过1,4-糖苷键连接而成的线性多糖。褐藻胶分子中包含3 种不同的聚合片段：聚甘露糖醛酸片段（polyM）、聚古罗糖醛酸片段（polyG）和杂聚物（polyMG）（图1）。褐藻胶广泛存在于褐藻的细胞基质和细胞壁中。

褐藻胶寡糖（AOS）是一种功能性低聚糖，是通过降解褐藻胶得到的含有2～10 个单糖的线性低分子质量聚合物。酶法降解可以定向制备具有特定单体组成和聚合度（DP）的AOS。中国水产科学研究院黄海水产研究所的崔永燕、杨敏*、刘楠等综述了酶法制备褐藻胶寡糖的方法及影响因素，并讨论了褐藻胶寡糖结构-功能的关系，以期为未来AOS的应用提供理论参考。

01

AOS的酶法定向制备

目前制备AOS的方法主要有化学降解、物理降解和酶法降解。酶法降解是在褐藻胶裂解酶的作用下使褐藻胶中的β-1,4-糖苷键断裂，在非还原端产生双键，从而制得不饱和AOS的一种方法。与物理和化学降解法相比，酶法降解具有反应条件温和、高效、特异性高、副产物少等优点。更重要的是，具有特异性的褐藻胶裂解酶可用于定向制备具有特定单糖组成和聚合度的AOS。

除了褐藻胶裂解酶可以特异性降解褐藻胶外，甘露糖醛酸C5-异构酶（MC5E）也可以用于定向制备AOS。MC5E是一种褐藻胶修饰酶，能够催化褐藻胶中M转化为其C5异构体G。在酶法定向制备AOS中，AOS的结构与酶的来源、性质、反应条件以及定向改造等有关。

1.1 制备AOS的酶的来源及分类

1.1.1 褐藻胶裂解酶的来源及分类

褐藻胶裂解酶主要来源于海洋藻类、海洋软体动物以及各种海洋和陆地细菌、真菌和病毒。褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶（PL），基于氨基酸序列，将褐藻胶裂解酶分为14 个PL家族（PL5、6、7、8、14、15、17、18、31、32、34、36、39、41）。根据其底物特异性，褐藻胶裂解酶可分为3 类：一类是具有G特异性的裂解酶（EC4.2.2.11），一类是具有M特异性的裂解酶（EC4.2.2.3），还有一类是可以同时降解polyM和polyG的裂解酶（EC4.2.2.-）。根据其作用方式可将褐藻胶裂解酶分为两种类型：内切型裂解酶和外切型裂解酶。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应降解褐藻胶，主要分为3 个反应步骤：1）带正电荷的氨基酸或金属离子中和羧酸根阴离子上的负电荷并降低H-5质子的pK a 值；2）C-5上质子经碱催化后形成烯醇中间体；3）催化酸提供质子，在C-4和C-5之间形成双键，导致4-O-糖苷键断裂并在非还原端生成4-脱氧-L-赤式-6-4-烯吡喃糖醛酸酯残基，最终生成不饱和AOS。

1.1.2 MC5E的来源及分类

MC5Es主要来源于细菌和真核生物。细菌来源主要包括假单胞菌属（Pseudomonas genera，如荧光假单胞菌、丁香假单胞菌和门多萨假单胞菌）和固氮菌属（Azotobacter genera，如棕色固氮菌和褐球固氮菌），真核生物来源包括褐藻、海带和昆布等。

根据MC5Es在生物体中的作用位置，可分为周质型和分泌型，分泌型MC5Es也可称为AlgE型。MC5Es可分为Ca 2+ 依赖型和非Ca 2+ 依赖型。所有来自棕色固氮菌的AlgE1-7均为Ca 2+ 依赖型。所有周质型甘露糖醛酸C5-异构酶AlgG（如丁香假单胞菌、棕色固氮菌、荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌中的周质AlgG）均为非Ca 2+ 依赖型。少数来自褐藻的MC5Es也是非Ca 2+ 依赖型。MC5Es也可以分为单功能和双功能MC5Es。例如棕色固氮菌中的AlgE2和AlgE7都具有异构酶活性和褐藻胶裂解酶活性。褐球固氮菌的AcAlgE2和AcAlgE3、门多萨假单胞菌的PmC5A也同时具有异构酶活性和裂解酶活性。

1.2 不同酶来源对产物的影响

不同来源的褐藻胶裂解酶可以制备具有不同结构的AOS。来自海洋细菌ATCC43367菌株的褐藻胶裂解酶，专门催化裂解polyM中1,4-糖苷键以产生MAOS。从海洋腹足类软体动物中分离的褐藻胶裂解酶，催化裂解polyG中的1,4-糖苷键，产生GAO。此外，来自海洋弧菌QY105的褐藻胶裂解酶AlyV5，通过降解polyG产生二糖、三糖和四糖，降解polyM产生三糖、四糖和五糖。

关于不同来源的特异性褐藻胶裂解酶的详细信息见表1。

1.3 反应条件对产物的影响

酶法制备AOS的反应条件，如酶的用量、温度、pH值、甘露糖醛酸与古罗糖醛酸比值（M/G）和金属离子等也会影响产物的结构和组成。从黄杆菌中获得的褐藻胶裂解酶在37 ℃、酶与底物比为14 U/2.0 g条件下降解30 min，得到的GAOS的DP为2～7。然而，当反应条件改变为50 ℃、酶解4 h、酶与底物比为50 U/1.0 g时，产物为DP 1～8的MAOS。当假单胞菌褐藻胶裂解酶HZJ 216降解褐藻胶（M/G为1.86），在30 ℃条件下降解反应6 h，产生AOS的平均分子质量为1.2 kDa，DP为2～6。然而，在相同的酶解反应条件下，褐藻胶的M/G为2.28时，产物主要是DP 2～3的AO。当Ca 2+ 浓度为2.5～3.0 mmol/L、Na + 浓度低于150 mmol/L时，AlgE7降解polyM和polyMG产生DP 1～2的GAOS；当Ca 2+ 浓度较低、Na + 浓度较高时，AlgE7降解polyM和polyMG先产生DP 3的AOS，然后利用其裂解酶活性，最后产生单糖和二糖。

1.4 酶的定向改造对产物的影响

天然褐藻胶裂解酶和MC5Es存在酶活性低、热稳定性差、催化效率低等问题。因此，需要通过定向改造手段，如定点突变、定向进化、理性设计、保守结构域重组、非催化结构域截断等修饰策略提高褐藻胶裂解酶和MC5Es的酶学性质。

定向进化和定点突变技术已被用作改造酶的强大工具。李树等利用定向进化技术提高了褐藻胶裂解酶Alg-2的活性。经过两轮易错聚合酶链式反应（PCR）和96 孔板发酵，得到两个阳性突变体，突变体的酶活性分别是原始酶的162%和241%。保守结构域重组和非催化结构域截断也可以增强褐藻胶裂解酶的活性。Li Shangyong等报道了全酶AlyL2（CBM 13结构域：T6-W133、PL7催化结构域：F167-H439）的活性约为其截断AlyL2-CM（PL7催化结构域）的2 倍。Yan Junjun等截断了褐藻胶裂解酶AlgH的F5/8C型结构域，显著提高了重建酶AlgH-I和AlgH-II的活性和热稳定性。通过截断非催化区（NCR）得到具有较高酶活性的Aly2-T282N和热稳定性好的cAlyM。这些研究结果表明，NCR、CBM和F5/8C型结构域可能会影响其催化结构域的结构以及酶的热稳定性和活性。

近年来，已采用几种分子修饰策略控制产物的分布，用于制备具有特异DPs的AOS。取代活性口袋中非催化位点上的残基可以改变AOS的DP。Tang Luyao等将VxAly7D的Trp295残基突变为Ala时，VxAly7D的最终产物由DP 1变为DP 1～3。Lyu Qianqian等从Vibrio OU02中克隆并鉴定了一种褐藻胶裂解酶AlyF，AlyF的主要产物是三糖。当用Ala取代Phe128、Arg取代Gln196时，该酶的主要最终产物由DP 3转变为DP 2～5。

定点突变技术是研究MC5Es的分子结构和作用模式的重要手段。Wolfram等通过定点突变技术证明了丁香假单胞菌中AlgG的催化残基为His319，并证实了影响AlgG结构和功能的关键氨基酸残基为Asp320、Asp317、Tyr314、Arg345和Arg415。

02

AOS的结构-功能关系

与褐藻胶相比，AOS分子质量较低，水溶性更好，具有更好的生物活性，AOS的结构特征会影响其生物活性。本节综述了影响AOS生物活性的相关结构因素，包括M/G、DP、非还原端结构和修饰等。

2.1 DP与AOS功能关系

周绪霞等通过酶法降解得到3 种不同分子质量的AOS（ADO-A：＞8 kDa；ADO-B：分子质量未进行分级；ADO-C：＜8 kDa），并研究其抗氧化活性，结果表明ADO-C的抗氧化活性最高，即分子质量较小的AOS表现出更强的抗氧化活性。张明杰等通过酶法得到4 种不同分子质量的AOS（A：0.84 kDa；B：1.40 kDa；C：2.25 kDa；D：34.56 kDa），发现各组分均具有一定的抗氧化活性和还原能力，可有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羟自由基，其中低分子质量组分A的抗氧化活性最强。由此可见，低分子质量AOS具有更好的抗氧化活性。

Chen Jiayu等利用褐藻胶裂解酶AlyL1制备得到4 种不同DPs（DP 2～5）的AOS，研究不同DP AOS的抗肿瘤作用，结果表明AOS（DP 5）对骨肉瘤MG-63细胞的生长具有最强抑制作用。Iwamoto等为研究不同DP AOS诱导RAW264.7细胞分泌细胞因子的活性，制备了MAOS（DP 3～9）、GAOS（DP 3～9），其中DP 8的GAOS和DP 7的MAOS表现出较强的诱导活性。这些研究结果表明，即使在相同的降解方式下，不同DP的AOS仍表现出不同的生物活性。

2.2 M/G与AOS功能关系

M和G是一对C-5异构体，C-5位点的异构化导致其低聚物的空间结构和理化性质存在差异。MAOS的β-1,4-糖苷键的赤道构型决定了polyM的伸缩链结构，而GAOS的α-1,4-糖苷键的轴向构象导致了polyG的螺旋构型。一般来说，轴向连接的polyG比等距连接的polyM具有更好的刚性，M残基含量高的褐藻胶具有更高的拉伸强度和伸长率。

AOS中M/G会影响其抑菌活性，G组分占总体含量85%以上的AOS抑菌效果更好，可能是GAOS与细菌的相互作用更强，但是其作用机制还存在争议。一系列研究表明，富含古罗糖醛酸的OligoG CF-5/20（G相对含量＞85%）可有效治疗慢性呼吸道疾病。Kurachi等研究不同分子质量和M/G的HAOS在RAW264.7细胞中诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）分泌的能力，发现在分子质量相近的情况下，M/G较高的HAOS表现出较高的TNF-α诱导活性。

2.3 非还原端结构与AOS功能关系

酶法降解褐藻胶在非还原端形成不饱和结构，生成不饱和AOS（UAOS）。然而，通过氧化降解制备的AOS在非还原端打开环形成羧基，形成饱和结构。不饱和末端结构和饱和末端结构是决定AOS生物学功能的关键因素。

Iwamoto等研究不同AOS诱导RAW264.7细胞分泌细胞因子活性，发现酶法制备的UAOS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α活性高于酸水解制备的饱和AOS，说明不饱和末端结构对诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α具有重要作用；BioPlex实验显示，UAOS也可以诱导白细胞介素（IL）-1α、IL-1β和IL-6等细胞因子的分泌。进一步的研究表明，不饱和MAOS（DP 3～6）比不饱和GAOS（DP 3～6）更能有效地诱导多种细胞因子的分泌，包括粒细胞集落刺激因子，其中DP 3的MAOS诱导细胞因子分泌的活性最高。

酶法制备的AOS是一种天然的抗氧化剂，可应用在在食品工业上。Falkeborg等采用酶法制备AOS并研究其抗氧化活性，结果表明UAOS能够完全抑制乳剂中的脂质氧化，而抗坏血酸的抗脂质氧化活性是UAOS的89%。此外，AOS也具有清除DPPH自由基、羟自由基和超氧自由基的活性。肥胖及其相关并发症已经成为影响人类健康的主要问题之一，然而，目前治疗肥胖的药物具有高成本和副作用大等缺点。Li Shangyong等研究表明UAOS作为一种绿色食品添加剂，在高脂饮食（HFD）喂养肥胖小鼠模型中显示出有效的抗肥胖作用。与酸水解制备的饱和AOS相比，UAOS能显著降低体质量和血脂水平。进一步研究表明，UAOS可以显著改善与肥胖相关的代谢异常，包括高脂血症、胰岛素抵抗和低度炎症。UAOS通过调节肠道微生物群减轻HFD诱导的肥胖及相关的代谢异常，说明UAOS可以作为一种益生元药物，能够有效治疗肥胖及其代谢异常问题。此外，这种抗肥胖作用只与不饱和末端结构有关，而与G或M组成无关。UAOS还具有免疫调节活性，He Ningning等研究UAOS对右聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎的改善作用，结果表明，UAOS通过调节肠道微生物群维持黏膜屏障功能，抑制免疫损伤。

2.4 修饰对AOS功能的影响

AOS可以被金属离子（如钒、铬和钠），也可以被非金属离子（如硒和硫）修饰。在AOS与活性离子结合后的相关衍生物表现出更好的生物活性。例如，在羟自由基和DPPH自由基清除系统中，与未修饰的AOS相比，钒基AOS（=VAOS）表现出更高的抗氧化活性。VAOS通过抑制磷酸酯酶与张力蛋白同源物（p=PTEN）的去磷酸化活性，激活活化蛋白激酶B（AKT）通路，提高细胞内活性氧（ROS）水平，从而诱导非小细胞肺癌（NSCLC）凋亡。骨骼肌中的胰岛素抵抗是导致糖尿病的关键因素，增强胰岛素敏感性和线粒体功能以及促进线粒体生物反应是预防和治疗2型糖尿病的关键。Hao Cui等发现MAOS能够改善C2C12骨骼肌细胞的胰岛素敏感性，当MAOS进入C2C12细胞后分布到线粒体中，增加了转录调控因子过氧化物酶增殖体激活受体γ辅助因子-1α、肉碱棕榈酰转移酶-1和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（p-ACC）的表达（图2），进而增加了能量消耗。MAOS通过激活胰岛素信号通路和腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）通路，改善了葡萄糖摄取并促进葡萄糖转运蛋白4（GluT4）的mRNA表达。进一步的研究发现，当MAOS与铬（III）复合时，增强了胰岛素敏感性。在预防和治疗2型糖尿病方面，MAOS-铬（III）复合物的效果更好。

AOS具有抑制肿瘤进展的功能，硫酸盐修饰的AOS可增强其抗肿瘤活性。Pan Zhen等研究AOS-SO 4 对骨肉瘤细胞的作用机制，结果表明，AOS-SO 4 通过抑制丝裂原活化的细胞外信号调节激酶1（MEK1）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号（mTOR）通路，促进细胞自噬并诱导细胞凋亡，进而发挥抗肿瘤作用。因此，AOS-SO 4 可以成为治疗骨肉瘤患者的一种新的潜在候选药物。Se-聚甘露糖醛酸（PM）是一种修饰的AOS衍生物，具有抗氧化、抗炎、神经保护等多种生物活性。 Bi Decheng 等 研究了 Se-PM 的抗炎活性及其作用机制 （图 3 ），发现 Se-PM 通过抑制 RAW264.7 细胞中核转录 因子（ NF- κ B ）和丝裂原活化蛋 白激酶（ MAPK ）信号 通路的激活，明显降低了脂多糖激活的小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞中 NO 、前列腺素 E2 （ PGE2 ）和 ROS 的生成，抑制了诱导性一氧化氮合酶 （ iNOS ）和环氧合酶 -2 （ COX-2 ）的表达以及促炎细胞因子 的分泌。

丙二醇硫酸钠（PSS）是通过水解、酯化和磷酸盐化褐藻胶制备得到的一种新型类肝素海洋药物，用于防治高脂血症和缺血性心脑血管疾病。Liang Haiyue等研究PSS对糖尿病db/db小鼠模型中高血糖和高脂血症的影响，结果显示，PSS（100 mg/kg）可有效降低db/db小鼠的空腹血糖水平和糖化血红蛋白水平，并且PSS还可以增强db/db小鼠对胰岛素的敏感性。此外，PSS还能在不影响饮食的情况下显著降低db/db小鼠的体质量，改善糖尿病小鼠的血脂代谢。表2列举了不同结构的AOS及其相应的生物活性。

03

结 语

AOS因其生物活性的多样性，被广泛应用在食品、医药等领域。AOS的生物活性与其结构密切相关，比如UAOS具有抗肥胖活性，且只与不饱和末端结构有关；M/G高的AOS具有更强的抗氧化活性；G组分含量占总含量85%以上的AOS抑菌效果更好。因此，阐明AOS的结构与活性之间的作用机理对于定向制备具有特定结构的AOS具有重要意义。目前，对AOS的制备工具——褐藻胶裂解酶的研究主要集中在提高酶活性和热稳定性方面，对影响底物特异性和产物分布的作用机制需要进一步探索和研究；对MC5Es的研究多来源于细菌，需要深入研究来源于真核生物，尤其是褐藻的MC5Es；对AOS的活性研究多集中在AOS混合物的生物活性上，对单一结构AOS的活性研究较少。未来对于AOS的研究，不仅需要建立能够高效、定向制备高纯度功能性AOS的方法，比如发酵法、生物合成法等，还需要深入研究AOS的结构与生物活性之间的关系，阐明其作用机制。

本文《褐藻胶寡糖的酶法定向制备及其结构-功能关系的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷10期320-329页. 作者：崔永燕，杨敏，刘楠，王珊珊，孙永，孙国辉，周德庆. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230512-109. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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