Sci Adv｜ERG钾离子通道家族的3个亚基在调节神经系统功能中的不同作用

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ERG（ether-à-go-go–related gene）K+通道家族由三个亚基erg1、erg2和erg3组成，通过同源或异源四聚体形成。研究表明，这三个亚基在啮齿类脑中都有表达，erg1和erg3亚基表达模式不同且重叠，erg2亚基表达较少。虽然erg K+通道能够调节神经细胞兴奋性，但每个erg亚基对单个神经元兴奋性和高级脑功能的具体作用仍不清楚。ERG通道具有“倒置”的门控动力学，即激活和去激活缓慢，但失活和从失活中恢复的速度很快。在人心脏中，erg1（HERG）电流控制动作电位复极化，其抑制会延长心室动作电位的平台期，增加早期去极化的可能性，从而引发心律失常和突然死亡。HERG的功能障碍可能是由于基因突变或药物诱导，但是ERG通道在神经元中的功能还不清楚，现有的研究表明三个ERG通道亚型具有不同的生物物理特性，可能控制不同的神经元功能。由于大脑中的erg2 mRNA表达不足，因此神经erg K+电流可能是亚阈值或超阈值电流，这取决于是否由erg3和/或erg1亚基组成同源或异源通道。在多个脑区中，erg通道已被证明介导亚阈值电流，即它们能稳定静息电位，减弱丘脑核神经元、嗅球二尖瓣细胞和海马CA1神经元等细胞的自发动作电位放电，而erg3亚基可能在这些例子中扮演重要角色。相比之下，神经erg1亚基可能有助于在更正的膜电位下参与erg K+通道，例如在感知神经元中调节重复动作电位的发射或在多巴胺神经元中控制长期动作电位的持续时间。

几乎所有关于erg型通道神经功能的研究中，都使用磺酰胺类药物如E-4031或WAY-123,398来阻断erg通道。磺酰胺类似物可以以相似选择性和效力阻断所有erg通道，因此是分离erg介导的K+通道电流与其他内源性离子通道电流的绝佳工具。然而，erg亚基的特异性药理学阻断剂目前还不存在，因此无法药理学地分离单个erg K+通道亚型。作为替代方案，转基因小鼠被用于鉴定神经erg通道，例如，在小鼠耳蜗的内毛细胞中发现了含有erg1的通道，这些通道介导参与精确编码声音的钾离子电流，erg3通道也曾在控制膜共振和静息电位附近的K+电流的下橄榄核神经元中被检测到。

德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心的Jürgen R. Schwarz和Matthias Kneussel研究团队在ScienceAdvances上发表论文Purkinje cell hyperexcitability and depressive-like behavior in mice lacking erg3 (ether-à-go-go–related gene) K+channel subunits，他们使用小鼠基因学研究erg3亚基对神经细胞兴奋性和行为的贡献，发现缺乏erg3亚基的小脑Purkinje细胞（Purkinje cells, PCs）变得过度兴奋，而海马CA1神经元的兴奋性保持不变。在小鼠的行为水平上，他们发现erg3亚基的缺失会引发类似抑郁的运动行为，而不是学习和记忆缺陷，且认为erg K+通道中的erg3亚基在调节神经细胞兴奋性和高级脑功能中扮演着关键角色。

图源 Science Advances

先前的研究结果表明，PCs中记录的erg电流是由含有erg1/erg3的异质K+通道介导的。为了确定由erg1和erg3亚基介导的电流，我们使用了两种不同的敲除（knock-out, KO）策略，研究人员使用基因编辑技术CRISPR-Cas9生成了两种基因敲除小鼠：一种是全局性敲除Kcnh7基因（编码erg3亚基）的小鼠，另一种是条件性敲除Kcnh2基因（编码erg1a亚基，具体来说是敲除PC中的Kcnh2）的小鼠。结果表明，erg3亚基的缺失不会影响大脑的发育和结构，而erg1a亚基的缺失则会影响神经元的兴奋性和行为。

图1 全局Kcnh7基因敲除和条件性PC细胞特异性Kcnh2基因敲除

研究人员比较了两种功能不同的神经元细胞类型：小脑PCs和海马CA1神经元，因为erg3电流在两种细胞类型中都可能占主导地位。通过在幼鼠脑切片中进行膜片钳实验，记录了PCs的膜电流。为了增强erg K+电流的幅度，实验中使用了高浓度的钾离子和无钙离子溶液。CA1神经元的erg K+电流记录则来自稍大一些的动物（2-4 周龄）。该实验使用失活协议，并利用erg钾离子通道对通道阻断剂E-4031的敏感性，通过将膜电位从-20 mV超极化，观察到由erg钾离子通道失活快速恢复和随后的缓慢失活产生的瞬时内向电流。研究发现，在缺乏erg1亚基的条件性Kcnh2敲除PCs中，E-4031敏感电流的幅度与野生型PCs相似，表明erg3是该细胞类型中形成erg钾离子通道的主要亚基。E-4031的应用显著增加了自发活动的放电频率，表明erg电流在PCs的活动中起着重要作用。

图2 将PC erg电流分解成两个部分

图3 Erg3 通道介导亚阈值电流，并参与静息电位的维持

研究发现，WT小鼠（wild-type littermate controls，即WT或Kcnh7+/+）的PCs的自发活动频率较低，且表现出不规则的持续或爆发性活动。为了研究erg3亚基缺失如何影响神经细胞的兴奋性和行为，在接近体温（33°C至36°C）且没有突触阻滞剂的情况下，研究人员在PCs和CA1神经元中进行了电流钳位实验。结果表明，阻断erg通道会增加神经元兴奋性，这可能是由于PCs的内在膜性质发生改变。在缺乏erg3亚基的小鼠PCs中，静息电位被初步去极化，并且在应用E-4031后，静息电位保持不变，表明erg3含有K+通道对于维持PCs的静息电位至关重要。缺乏erg3亚基的小鼠PCs表现出比野生型PCs更高的自发静息活动，其兴奋性与在E-4031存在下记录的野生型PCs相似。总之，研究人员得出结论：缺乏erg3亚基的PCs具有高兴奋性。

图4 缺乏erg3通道亚基（Kcnh7-KO）的PC表现出过度兴奋的特性

电压门控K+通道对神经元的兴奋性和行为至关重要，而其中erg K+通道尚不完全清楚，它们是否以及如何参与行为调节尚不清楚。因此，研究团体探究了缺乏erg3亚基的成年WT小鼠和KO幼崽，使用了广泛的行为范式，包括运动行为、认知表现和/或社会互动。

在第一实验中，研究人员使用开放场测试来研究探索行为和总活动水平。研究发现，Kcnh7-KO小鼠在旷场试验中，前期移动距离与野生型小鼠相似，但后期移动距离明显减少，平均速度也随时间下降，但与墙壁的平均距离保持一致。在第二组实验中，研究人员测试了焦虑（高架迷宫）和社会认知，发现所有基因型的表现都一样好。在新的物体识别测试中，野生型和Kcnh7-KO小鼠在实验第2天对两个相同物体的时间花费相同，并在第3天对新物体花费更多时间，表明K+通道包含erg3亚基不参与识别记忆的调节。然而，Kcnh7-KO小鼠在新的物体识别测试第3天移动距离明显减少，类似于在开阔场观察到的情况，表明整体活动减少或运动活动减少。

在高架迷宫实验中，高架十字迷宫由聚乙烯泡沫塑料制成，底部为可拆卸白色塑料地板，高80厘米，并用柔和的昏暗光照（25 lux）。迷宫由四条等间距的臂（长度30 cm，宽度5 cm）辐射到一个中心方形（5 cm×5 cm）。一对相对的臂被封闭在不透明的墙壁内，而另外两条臂则敞开，边缘沿外侧有2 mm高的围栏。安装在迷宫上方数码相机捕捉图像，并传输到运行动物行为追踪软件的电脑上。每次试验，将小鼠放置在中心方形，面向一个开放的臂，允许它在5分钟内自由探索，然后被移除并返回到家笼。记录了两个指标：小鼠在开放臂中花费的时间百分比和5分钟内总行驶距离。

图5 Kcnh7-KO小鼠表现出运动活动减少

研究人员进一步使用转棒测试来研究运动行为，它可以提供运动平衡、协调、握力和耐力方面的信息。研究发现，缺乏erg3亚基的KO小鼠在加速转盘测试中表现明显较差，这表明其运动平衡、协调、握力及耐力都受到影响。与野生型对照动物相比，KO小鼠在转盘上停留的时间明显更短，尤其是在速度增加和试验间隔缩短的情况下。这种表现与KO小鼠海马神经元的异常兴奋性相关。此外，多重相关矩阵分析也证实了erg3亚基缺失导致的运动活动减少的趋势。

转棒实验使用Ugo Basile加速转盘测试仪对小鼠进行测试。测试环境光照为30 lux的柔和白光，并使用数字摄像头捕捉视频，通过Ethovision追踪软件传输到计算机。测试分两步进行：第一天，小鼠进行五次试验，每次试验之间间隔50到60分钟。第一次和第二次试验以慢速恒定速度（4 转/分钟）进行，最大持续时间为3分钟。第三次到第五次试验以加速速度进行，从4转/分钟到40转/分钟，持续时间为4分钟，最大持续时间为10分钟。第二天，进行三次加速试验，每次试验之间间隔10 - 15分钟，通过记录小鼠在旋转杆上保持的时间来评估其表现。这项任务对小鼠的运动协调能力、运动能力和保持在杆上的动力要求很高。

图6 多重相关矩阵显示运动活动普遍下降

研究人员通过“埋珠测试”（Marble burying test）比较了WT和Kcnh7-KO小鼠的挖掘行为。结果显示，WT小鼠在30分钟内掩埋了大约70%的玛瑙，而Kcnh7-KO小鼠的挖掘行为明显减少，掩埋的玛瑙数量也远少于WT小鼠。WT小鼠表现出频繁且强劲的挖掘行为，而Kcnh7-KO小鼠则几乎没有。WT小鼠花费在挖掘上的时间比Kcnh7-KO小鼠多，甚至Kcnh7-KO小鼠的站立次数也明显减少。由于挖掘被认为是一种内源性重复运动活动，因此掩埋的玛瑙数量可以作为活力指标。综上所述，研究人员得出结论，erg3亚基的减少会导致运动功能、耐力和活力的下降，类似于类似于抑郁的行为。

实验将两只笼子（26.7 cm×42.7 cm）填充到5 cm深度的细木屑中，并在上面均匀放置一个由20个黑色玻璃珠（直径16 mm）组成的5×4网格。在20 lux的微弱白光下，将老鼠放入笼子中，观察并录像30分钟。每5分钟记录埋藏的玻璃珠数量。如果超过三分之二的珠子被木屑覆盖，则被认为是埋藏的。实验之间，将木屑彻底搅拌、压平，并重新放置珠子。埋藏的珠子数量在5分钟的时间间隔内手动计数。

图7 Kcnh7基因敲除小鼠的运动能力明显下降（通过埋珠测试）

本文研究了erg K+通道亚基在调节小鼠神经元兴奋性和行为中的作用。研究人员通过基因编辑技术产生两种小鼠，即erg3亚基（Kcnh7-KO）全身敲除小鼠和特异性在Purkinje细胞中敲除erg1亚基（Kcnh2-KO）的条件敲除小鼠。他们发现，PCs中的erg电流由erg1和erg3亚基介导，而海马CA1神经元中的erg电流主要由erg3亚基介导。缺失erg3亚基导致Purkinje细胞高兴奋性，但不影响CA1神经元。在行为水平上，erg3敲除小鼠表现出抑郁样表型，包括运动活动降低、挖掘行为减少以及从旋转轮上掉落的潜伏期缩短，而学习记忆未受影响。这些结果表明，含有erg3亚基的erg K+通道在调节神经元兴奋性和与运动行为相关的高级脑功能中起关键作用。

这些发现为进一步探索erg K+通道在神经系统功能调控中的作用提供了重要线索，未来的研究可以进一步深入分析erg3通道在不同神经元类型中的具体调控机制，以及其在情绪调节、运动控制等高级脑功能中的作用。此外，也可以探讨erg通道在神经系统疾病发病机制中的潜在作用，为相关疾病的诊断和治疗提供新的靶点。

原文地址

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adn6836#sec-4

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