【Adv. Sci.】南方医科大学发文：发现肝癌治疗小分子靶点

【导读】肝细胞癌(HCC)常发生在纤维化或肝硬化的背景下。组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传机制，但目前尚不清楚组蛋白甲基转移酶是否为纤维化相关HCC治疗的有效靶点。

10月8日，南方医科大学研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“ASH1L in Hepatoma Cells and Hepatic Stellate Cells Promotes Fibrosis-Associated Hepatocellular Carcinoma by Modulating Tumor-Associated Macrophages”，本研究中，研究人员发现ASH1L是一种H3K4甲基转移酶，在活化的肝星状细胞(hsc)和肝癌细胞中水平较高。为了确定ASH1L在体内的作用，研究人员在肝细胞系(Ash1lflox/ floxalbre)或肝星状细胞(Ash1lflox/floxGFAPcreERT2)中建立了敲除ASH1L的转基因小鼠，并在二乙基亚硝胺(DEN)/四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化和HCC模型中挑战这些小鼠。在肝细胞和肝星状细胞中敲除Ash1l可减轻肝纤维化和HCC发展。多色流式细胞术、批量和单细胞转录组测序表明，ASH1L可创建免疫抑制微环境。在机制上，ash1l介导的H3K4me3修饰增加了CCL2和CSF1的表达，从而募集和极化了M2样促肿瘤巨噬细胞。M2型巨噬细胞进一步促进肿瘤细胞增殖，抑制CD8+ T细胞活化。AS-99是ASH1L的小分子抑制剂，具有类似的抗纤维化和肿瘤抑制作用。具有病理生理意义的间质型ASH1L和M2型标志物CD68表达水平升高与HCC不良预后相关。这些发现揭示了ASH1L是一个潜在的治疗纤维化相关肝癌的小分子靶点。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202404756

背景介绍

01

肝细胞癌(HCC)是全球第五大最流行的癌症类型和第三大癌症死亡原因。不论其病因不同，大多数HCC病例(80-90%)发生在纤维化或肝硬化的背景下。肝硬化患者发生HCC的概率是非肝硬化患者的2-45倍。因此，了解纤维化或肝硬化相关HCC背后的机制至关重要。

纤维化及其更晚期的形式，肝硬化，涉及肝细胞的持续损伤和再生，以及基质硬度增加和对肿瘤的免疫监视减少的微环境改变。在这些变化中，肝星状细胞(HSC)的活化是肝硬化癌变的核心驱动因素。肝损伤后，HSCs被激活，从储存维生素A的静止细胞转分化为增生性纤维性肌成纤维细胞。细胞命运示踪也表明活化的肝星状细胞是肝肿瘤中肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的主要来源。活化的HSCs不仅能促进细胞外基质(ECM)的产生，还能表达趋化因子和炎症因子来调节肝脏环境。在纤维化的肝脏中，去除或抑制活化的肝星状细胞可显著抑制HCC的发展，这表明清除活化的肝星状细胞可能是降低HCC发展风险的一种有前景的方法。

ASH1L在纤维化相关HCC中创建了免疫抑制微环境

02

研究人员对转基因小鼠组织进行了转录组测序，以揭示ash1l介导的纤维化和HCC发展背后的机制。生物过程(BP)和分子功能(MF)的基因本体论(GO)功能富集分析显示，DKO组和WT组的差异表达基因主要富集在细胞因子及其受体介导的免疫系统过程。为了评估DKO和WT小鼠的免疫细胞组成，研究人员应用了多色流式细胞术。流式细胞术结果表明ASH1L可能影响BM来源巨噬细胞的募集。研究人员将单细胞RNA测序(scRNA-seq)进一步用于全面研究转基因小鼠肿瘤组织中单个细胞群的转录组学特征。越来越多的证据表明，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是复杂的肿瘤微环境(TME)的关键组成部分，其不同的亚群和复杂的异质性可表现出促肿瘤或抗肿瘤的功能。ScRNA-seq结果显示，与WT组相比，在DKO组中，以SPP1+ TAM和CD300e/Id+ TAM为代表的促肿瘤TAM亚群的比例降低，而以CXCL9+ TAM为代表的抗肿瘤TAM细胞的比例升高。免疫组织化学(IHC)染色证实，M2型巨噬细胞标志物CD68和ARG1在DKO小鼠中低于WT小鼠。T细胞亚群分析显示，与WT组相比，DKO组中辅助性T细胞和活化的CD8+ T细胞(CD8ac)的比例更高。综上所述，这些观察结果表明，ASH1L在肝细胞和肝星状细胞中的表达通过影响m2样促肿瘤TAMs和活性CD8+ T细胞的组成来创建一个免疫抑制微环境。

肝细胞和HSC中ASH1L的表达在纤维化相关的HCC中创造了免疫抑制微环境

抑制ASH1L及其下游效应物在HCC中的治疗潜力

03

为了评估ASH1L抑制在HCC中的治疗潜力，研究人员在DEN/ ccl4诱导的小鼠模型中使用CCL2中和抗体(CCL2 Ab)和CSF1R抑制剂BLZ945来阻断CCL2和CSF1信号传导。den - ccl4给药后18周，小鼠肝脏开始形成纤维化病变，提示HSC活化和ASH1L表达上调。然后给予ccl2ab和BLZ945联合治疗。与IgG+DMSO对照组相比，该联合治疗在不影响肝体重比的情况下显著减少肿瘤数量。免疫组化和流式细胞术分析显示，CCL2 Ab和BLZ945处理抑制F4/80+巨噬细胞浸润，降低M2巨噬细胞标志物CD206的表达。这些发现表明，靶向ASH1L下游的CCL2和CSF1信号通路是在纤维化微环境中抑制肝癌进展的可行策略。

此外，研究人员还研究了ASH1L抑制剂AS-99的体内治疗效果。为了确定最佳剂量，C57BL/6小鼠连续三次注射不同剂量的AS-99。蛋白质免疫印迹实验分析表明，30mg kg−1剂量显著抑制肝组织中H3K4me3修饰，对H3K36me3修饰影响最小。通过向C57BL/6小鼠肝脏注射Hepa1-6细胞建立原位肝癌模型。注射后14天，连续三次注射CCl4诱导纤维化。研究表明AS-99治疗显著抑制原位肝癌生长。虽然as -99治疗组肝体重比呈下降趋势，但该模型的低肿瘤形成率使其无法进行充分的比较。非致瘤性小鼠肝组织免疫组化染色显示，AS-99处理后，所有处理小鼠的F4/80+和CD68+巨噬细胞浸润均受到显著抑制。这些发现表明，AS-99不仅抑制HCC的生长，而且即使在没有肝肿瘤的情况下，也会阻碍肝微环境中巨噬细胞的募集和极化。RT-qPCR分析进一步证实，AS-99处理抑制了CCL2和CSF1的表达，证实了ASH1L对这些趋化因子的调节作用。总之，这些结果表明，阻断ASH1L下游的CCL2-CSF1信号通路或直接抑制ASH1L酶活性有望成为治疗ASH1L介导的HCC的临床方法。

遇到的挑战

04

肿瘤环境中细胞的表观遗传重编程对临床实施有效的肿瘤管理至关重要。然而，确定对纤维化相关肝癌发生至关重要的特定表观遗传调控因子仍然是该领域最具挑战性的问题之一。

【参考资料】

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202404756

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