科研思路：糖酵解＋巨噬细胞＋代谢组学＋转录组学

来源：好本子

2024 年 4 月发表在 Advanced Science 杂志上的这篇研究论文，探讨炎症性成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）衍生的外泌体如何通过增强巨噬细胞的糖酵解作用来加剧骨关节炎（OA）的病理进程。通过结合代谢组学和 RNA 测序分析，论文全面地描绘了外泌体对巨噬细胞代谢和基因表达的影响，为深入理解其在 OA 中的作用机制提供了多维度的数据。此外，论文不仅在体外细胞模型中验证了外泌体的作用，还通过在小鼠 OA 模型中的体内实验进一步证实了其对疾病进展的影响，增强了研究结论的可靠性。

图源：Advanced Science

研究背景

骨关节炎（OA）一种常见的关节疾病，是一种影响关节囊内外多个解剖结构的全身性疾病，目前，OA 的治疗主要集中在使用局部或口服非甾体抗炎药来缓解疼痛，而对于晚期 OA 患者，需要不可避免地使用到关节置换手术。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是健康和 OA 滑膜中最丰富的细胞类型，此外巨噬细胞也在 OA 中起着关键作用，该研究 旨在研究 FLSs 衍生的外泌体及其在 OA 发展中的作用以及这些外泌体如何影响巨噬细胞的极化和功能，从而为 OA 治疗提供新的视角和潜在靶点。

研究思路

研究团队分析了来自 OA 患者和对照组的滑膜组织样本，观察到 OA 患者 FLSs 中外泌体分泌的增加，以及与炎症相关的生物标志物的变化。接下来，研究团队使用体外细胞培养模型，模拟 OA 中的炎症环境，分离外泌体并通过纳米粒子追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和西方印迹法（WB）等技术对它们进行表征，随后利用 Seahorse 生物能量分析仪评估巨噬细胞代谢并通过 RNA 测序（RNA-seq）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和 WB 等技术，分析外泌体刺激的巨噬细胞中基因和蛋白表达的变化。最后进行体内模型验证以及药物干预实验阐明外泌体在 OA 中的作用机制，并探索新的治疗策略。

研究结果

1. 外泌体分泌在 OA 滑膜和炎性 FLS 中升高

对比来自 OA 患者和对照组的滑膜组织样本的 HE 染色图像，研究团队发现 OA 滑膜中存在大量细胞浸润。为了研究滑膜外泌体在 OA 中的作用，研究团队分析了外泌体生物发生的关键调节因子 RAB 27 A 的表达，发现 OA 滑膜中 RAB27A 表达上调，提示外泌体分泌在 OA 中增加。此外，研究团队使用体外细胞培养模型，模拟 OA 中的炎症环境，刺激 FLSs 并观察外泌体的分泌情况，纳米颗粒示踪分析显示体外炎症刺激下，FLS 外泌体分泌也增加。

图 1：外泌体分泌在 OA 滑膜和炎性 FLS 中升高

2. 炎症性 FLS 源性外泌体在 M1 极化中的病理作用

基因本体富集分析显示 iNOS 阳性细胞（M1 样巨噬细胞的标志物）和 NLRP 3 阳性细胞（炎性小体活化的标志物）显著增加。鉴于滑膜内 FLS 和巨噬细胞之间空间接近，研究团队假设来源于炎性 FLS 的外泌体破坏巨噬细胞极化。通过体外共培养系统和直接刺激，研究显示外泌体增加了 M1 型巨噬细胞标记物的表达。关节内注射等体积的非 OA FLS 衍生的外泌体、IL-1β 刺激的 OA FLS（inf-exo）的外泌体或生理盐水后，inf-exo 注射导致滑膜增生和细胞浸润显著增加。总的来说，以上研究结果说明来源于炎性 FLS 的外泌体可以在体外和体内诱导 M1 样巨噬细胞极化。

图 2：炎症性 FLS 源性外泌体在 M1 极化中的病理作用

3. inf-exo 预处理的巨噬细胞诱导共培养软骨细胞 OA 样表型

软骨变性是 OA 的主要病理表现，其特征是过度活化的分解代谢和细胞凋亡。考虑到巨噬细胞在 OA 中的病理作用，研究团队假设用 inf-exo 引发的巨噬细胞可能会破坏共培养软骨细胞的行为，共培养后进行实验发现 inf-exo 预处理的巨噬细胞在共培养条件下对软骨细胞产生了负面影响，包括蛋白多糖含量降低、合成代谢标志物减少、细胞活力降低、细胞凋亡增加以及软骨细胞的代谢状态改变。综上所述，这些发现表明，用 inf-exo 引发的巨噬细胞可以在共培养的软骨细胞中诱导 OA 样表型。

图 3：inf-exo 预处理的巨噬细胞诱导共培养软骨细胞 OA 样表型

4. 关节腔内注射 inf-exo 促进小鼠实验性骨关节炎的形成

随后，研究团队在小鼠模型中进行关节腔内注射 inf-exo, 发现来源于炎性 FLS 的外泌体在体内也能加剧 OA 的进展，表现为更严重的软骨退化和滑膜炎症的加剧。

图 4：inf-exo 预处理的巨噬细胞诱导共培养软骨细胞 OA 样表型

5. inf-exo 触发的糖酵解激活促进巨噬细胞炎症

在外泌体刺激巨噬细胞 48 小时后，研究团队观察到细胞培养上清液颜色的显著变化，表明外泌体刺激导致上清液 pH 水平的变化，进一步研究发现糖酵解活化关键的酶 GLUT1、HK2、PKM2 和 LDHA 表达水平增加，进一步采用 Seahorse 测定来研究细胞糖酵解的状态，观察到用 inf-exo 处理的巨噬细胞中显著更高的糖酵解速率和增强的糖酵解能力，靶向代谢组学分析也表明糖酵解在 inf-exo 刺激的巨噬细胞中被激活。使用 2-DG 破坏巨噬细胞糖酵解后可以减轻 M1 型极化和炎症激活。这些发现表明糖酵解可能是 M1 样极化和炎症基因表达的潜在机制。

图 5：inf-exo 触发的糖酵解激活促进巨噬细胞炎症

6. HIF1A 是 inf-exo 触发的糖酵解激活和极化的关键转录因子

inf-exo 刺激的巨噬细胞中四种糖酵解基因（Slc 2a 1、Hk 2、Pkm 和 Ldha）显著增加。通过 ChIP 分析筛选了上述四种糖酵解基因的上游转录因子，此外，基于 ChEA 3 数据库的预测，HIF 1A 被鉴定为排名第一的转录因子。CHIP 实验证明 inf-exo 刺激的巨噬细胞在启动子区中显示出积聚 HIF 1A 的显著增加。然后，研究团队在体内和体外研究了 OA 下 HIF 1A 的表达发现 OA 患者的滑膜中 HIF 1A 表达上调。PX-478 抑制 HIF 1A 后，inf-exo 诱导的 M1 样极化和糖酵解酶的上调作用被减弱。总的来说，研究显示 HIF1A 在调控糖酵解基因表达中发挥重要作用。

图 6：HIF1A 是 inf-exo 触发的糖酵解激活和极化的关键转录因子

7. HIF1A 药理学抑制减轻 inf-exo 触发的巨噬细胞病理作用

为了研究 HIF 1A 在 inf-exo 触发的巨噬细胞功能障碍中的作用，研究团队在 inf-exo 刺激之前以及与软骨细胞共培养之前，使用 PX-478 抑制巨噬细胞中的 HIF 1A 表达和活性，研究显示使用 HIF1A 抑制剂 PX-478 后，巨噬细胞对软骨细胞的促分解作用显著减弱，细胞增殖标记物和抗凋亡蛋白表达恢复，巨噬细胞对软骨细胞的负面影响减少，此外，小鼠 OA 模型中注射 PX-478 可通过抑制滑膜 HIF 1A 来减弱实验性 OA 的发展。

图 7：HIF1A 药理学抑制减轻 inf-exo 触发的巨噬细胞病理作用

文章小结

总的来说，该论文研究了炎症性成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）衍生的外泌体在骨关节炎（OA）中的作用。研究发现， 这些外泌体在 OA 中分泌增加，并通过增强巨噬细胞的糖酵解和 M1 型极化来加剧炎症反应，从而促进 OA 的进展。HIF1A 作为关键的转录因子，调控了这一过程中糖酵解基因的表达。 研究还发现，通过药理学手段抑制 HIF1A 能够减轻 OA 的病理变化，显示出作为潜在治疗策略的前景。这些发现为理解 OA 的发病机制提供了新的见解，并可能指导未来的治疗干预。

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