《Matter》:可注射脂质体水凝胶用于多种蛋白质药物的可编程释放

（Correa S, Grosskopf AK, Klich JH, et al. Injectable Liposome-based Supramolecular Hydrogels for the Programmable Release of Multiple Protein Drugs. Matter. 2022;5(6):1816-1838.）

引导 生物功能是组织和免疫工程领域下一代生物医学计划的核心。 本研究开发了一种可精确控制多种蛋白质药物释放的可注射脂质体纳米复合水凝胶平台，该平台结合了脂质纳米技术和超分子自组装的原理，通过在水凝胶中整合模块化的脂质纳米技术，实现了基于脂质体表面化学性质的多种蛋白质释放机制。为验证该系统在多蛋白质递送中的应用，研究者在体内实现了 IgG抗体和IL-12细胞因子的同步、持续和局部释放 。

目前尚无微创递送技术可以调节多种蛋白质药物在体内的相对释放速率。为了解决这一技术差距，作者开发了一种由十二烷基改性羟丙基甲基纤维素 （HPMC-C12）和脂质体纳米颗粒构建单元（方案1A） 组装 的超分子水凝胶平台。 作者在免疫功能正常的小鼠中进行了临床前毒理学研究，以确定脂质体纳米水凝胶（ LNH ） 的生物相容性 ，并 通过正交被动、静电和基于亲和力的释放机制 确定了L NH 具有可 分阶段 释放 蛋白质药物的能力（方案 1B）

方案1. 使用脂质体作为构建单元制备用于递送各类蛋白质药物的可注射水凝胶方案。

为了确定 LNH的自我修复能力 ， 进行了阶梯剪切实验，其中材料经历了高剪切和低剪切条件的多次循环（图1C）。2P-10L水凝胶的动态振荡剪切流变学在整个评估频率范围内显示出稳健的类固体特性（G'大于G''）（图1A） ， 这表明水凝胶 的 成功 构建 ，并且与 已报道 的基于脂质体的水凝胶不同，这些LNH在低频振荡状态下未显示G'和G''的交叉。相比之下，当脂质体与未改性的HPMC混合时，不会形成水凝胶，表现出液体状特性（G''大于G'）。此外，没有脂质体的HPMC-C12溶液也无法形成坚固的水凝胶。

LNH显示出剪切稀化和自愈特性，适合 作为可注射的药物存储库 。在高剪切条件下，LNH的粘度下降了大约4个数量级（图1B），表明在高剪切力下LNH网络结构被破坏，而 该 结构可以自发再生 并 在注射后重新凝固。阶梯剪切实验结果显示，一旦高剪切条件暂停，LNH的粘度能迅速恢复到原始水平（图1C）。LNH 可 通过26G针头轻松注射，并在注射后重新凝固（图1D）。

图1. 脂质体水凝胶具有剪切稀化和自修复机械特性，可通过针头注射。

作者研究了脂质含量对脂质体水凝胶机械性能的影响。随着脂质含量从 1 wt%增加到10 wt%，水凝胶变得更硬且更像固体（图2A-B）， 且 G'和G''没有交叉，表明形成了稳固的水凝胶。每种配方的振幅扫描显示 水凝胶具有 高应变、平滑的屈服过渡且无脆性断裂。LNH系统的模量（E从0.3到1 kPa）与常用的藻酸盐系统（0.2到1.3 kPa）相当，适用于软组织和免疫工程应用（如T细胞工程）。

脂质含量超过 1%时，各配方的屈服应变行为一致（图2C-D）。流动扫描（图2E-F）显示，这些配方具有极端的剪切稀化行为、最小的触变性和显著的屈服应力值，表明它们适合维持皮下蛋白质储库，能够承受低但恒定的应力。

图2. 脂质体水凝胶的机械性能受水凝胶中脂质体浓度的调节。

接下来研究了脂质体大小对水凝胶机械性能的影响。由于脂质体大小增加导致每单位体积脂质体减少，颗粒间距增加，脂质体表面积减少，这可能降低交联效率。研究数据显示，增加脂质体大小会降低水凝胶的刚度，但仍保持类固体特性（图 3A-B）。尽管刚度（G'）和类固体特性（tan delta = G“/G'）通常相关， 但 这种系统能在不改变类固体特性的情况下独立调整刚度。所有配方都表现出高产率应变（>250%）（图3C-D）和可测量的屈服应力行为（图3E-F）。

图3. 脂质体大小对脂质体水凝胶流变特性的影响。

拉伸流变学在注射过程中非常重要 。为了进一步研究粘性和拉伸特性，作者进行了细丝拉伸流变学 分析 ，以评估 不同 配方的断裂应变（图4）。值得注意的是，作者观察到所有配方在几个应变速率下 均具有 极高 的 可扩展性， 甚至 高于 已 报道的所有其他物理交联生物材料。 作者观察到随着脂质体大小的增加，延展性显著增加（图 4D）。

图4.脂质体大小对脂质体水凝胶拉伸特性的影响。

为确认脂质体水凝胶在生物医学中的应用，作者在免疫正常的 C57BL6小鼠中进行了毒理学研究。将100 μL的脂质体水凝胶（2% HPMC-C12; 4% 脂质体; 2P-4L）皮下注射到小鼠后腹部，观察到形成明确的球形（图5A）。在接下来的一周里，作者监测了小鼠是否有皮肤刺激、体重减轻或其他疾病迹象，并用卡尺跟踪水凝胶的大小。结果显示，2P-4L制剂未引起皮肤刺激（图5B-C），且水凝胶随着时间缓慢溶解，在第7天完全消失（图5D-E）。小鼠体重保持稳定（图5F）， 未展现出 毒性或炎症迹象。

在注射后第 7天，作者收集血清 以 评估肝肾毒性。结果显示水凝胶处理组与对照组在AST/ALT比率、ALP水平、BUN和肌酐水平上无显著差异（图5H-I），未见急性肝肾毒性。组织学分析显示，水凝胶切片的H&E染色表现出明显的细胞浸润，尤其是在水凝胶内的ECM链上，几乎没有纤维化和多核异物巨细胞（图5K-L）。三色染色进一步确认了水凝胶中胶原蛋白的丰富沉积。总体而言，毒理学和组织学数据显示脂质体水凝胶在皮下间隙具有良好的耐受性，易于被驻留细胞（如巨噬细胞）浸润。

图5. 脂质体水凝胶具有生物相容性，可在体内生物降解。

接下来，作者研究了 控制 脂质体水凝胶中蛋白质释放的策略（图6A）。首先，通过荧光恢复光漂白（FRAP）实验，作者研究了分子大小对水凝胶内扩散的影响。结果显示，高分子量治疗剂（~2,000 kDa）在水凝胶中的释放较慢， 表明该体系对 大分子输送具有潜力。在40到250 kDa范围内，释放动力学与水凝胶的被动释放一致，聚合物的表观网格尺寸估计为4.45 nm。

接着，作者探索了两种基于亲和力 控制蛋白质释放 的策略。首先，评估了静电相互作用对带电蛋白质释放速率的影响（图6A-ii）。引入组氨酸his标签后，发现其通过静电作用显著降低了蛋白质的释放速率。his-GFP的50%释放需要9天，而野生型GFP在4天内释放50%（图6D），表明his标签与阴离子脂质体的静电相互作用显著延缓了释放。

为进一步调节蛋白质释放，作者设计了含3 mol% NTA（Ni）或NTA（Co）功能化磷脂的脂质体（图6A-iii）。这些NTA基序对his标签表现出高亲和力。结果表明，NTA功能化脂质体显著降低了his-GFP的释放速率，在30天内仅释放了34.1%（NTA（Ni））和28.0%（NTA（Co））的his-GFP，显示出亲和力控制的释放机制更有效。

图6.调控脂质体表面化学性质调节蛋白质货物的释放速率。

为了验证阴离子脂质体水凝胶（ LNH）系统是否能显著减缓IL-12的释放，研究者在免疫功能正常的SKH1E小鼠中进行实验，将荧光标记的IgG和IL-12蛋白通过脂质体水凝胶或推注方式皮下递送（图7A），并使用体内成像系统（IVIS）同时分析两种蛋白质的释放。研究者选择了2P-10L制剂进行体内释放研究，假设其更强的机械性能会延长药物持久性。由于脂质体制剂具有阴离子电荷且之前已被验证 可作 为有效的药物载体，因此被选为基础制剂。每种蛋白质都用独特的荧光团标记以实现同时追踪。IVIS成像结果显示，推注方式导致IgG和IL-12在不到一天的时间内迅速消失，而脂质体水凝胶则能同步缓慢释放这两种蛋白质，即使在14天后，仍有超过50%的荧光信号保留。

图7.脂质体水凝胶能够在体内同步持续地共同递送IgG 抗体和 IL-12 细胞因子药物。

结论：

本研究开发了一种可注射的脂质体纳米复合水凝胶生物材料，并展示了其在体外和体内可编程释放多种蛋白质货物的效果。剪切和拉伸流变学结果表明，脂质体水凝胶体系是高度可调的模块化材料，具有凝胶状特性和快速自愈性，并易于注射，适合在给药后持续释放药物。研究表明，该水凝胶体系对脂质体结构单元的修饰具有高度稳定性，尤其是在其表面化学方面。此外，这些材料独特的延展性表明其具有药物递送以外的应用前景，例如 3D生物打印或生物粘合剂。

https://www.cell.com/matter/fulltext/S2590-2385(22)00109-6

来源：Y L的卡布奇诺