FSHW | 异槲皮素通过IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路缓解良性前列腺增生

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Abstract

本文评估了异槲皮素（槲皮素-O-3葡萄糖苷-槲皮素，IQ）作为一种翅果连翘叶的乙醇提取物（ADLE）的功能成分对前列腺细胞增殖和凋亡及其对良性前列腺增生（BPH）IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路的影响。采用UHPLC-qTOF-MS和HPLC对ADLE中的代谢产物进行了分析。将IQ口服给药（1或10 mg/kg）给丙酸睾丸酮诱导的BPH大鼠模型，并评价其对前列腺重量的影响。分析了IQ对LNCaP细胞中雄激素受体（AR）信号转导的影响。还检查了IGF-1和IQ是否影响BPH-1细胞中的IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路。对ADLE中的代谢产物进行鉴定和定量，证实ADLE含有丰富的IQ（20.88 mg/g）。在BPH大鼠模型中，IQ显著降低中前列腺的大小，并以浓度依赖的方式显著降低大鼠前列腺组织和LNCaP细胞中AR信号因子的表达。IQ也抑制了BPH-1细胞中IGF-1激活的PI3K/AKT/mTOR通路。在BPH-1细胞中，IQ导致G0/G1期阻滞，抑制增殖因子的表达，同时诱导细胞凋亡。因此，IQ显示出用作BPH药物和营养保健品的潜力。

Introduction

良性前列腺增生（BPH）是一种与男性衰老有关的慢性疾病，但其确切病因仍不清楚。BPH常引起膀胱出口梗阻、下尿路症状，严重时可引起肾功能衰竭和膀胱失代偿。随着社会的老龄化,BPH患者的数量将继续增加。BPH的药物治疗仅限于α受体阻滞剂，5-α还原酶抑制剂和磷酸二酯酶5抑制剂。

BPH被认为主要是由于随着年龄的增长，内分泌功能恶化导致雄性激素分泌减少，并与代谢综合征、高胰岛素血症、种族、肥胖、高血压、糖尿病、低密度胆固醇和吸烟有关。雄激素与AR的结合，配体诱导的转录因子对前列腺的生长发育至关重要。然而，过度的AR被认为是前列腺癌和前列腺增生的主要因素。另一方面，男性的循环雄激素水平随着年龄的增长而降低，但有报道称BPH患者前列腺中的睾酮水平与正常人相似。据报道，增生组织的前列腺二氢睾酮（DHT）水平比正常前列腺高出好几倍。这表明，将睾酮转化为DHT的雄激素结合雄激素受体（AR）和2型5α还原酶（5AR2）的活性参与了BPH的发生。此外，磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素机制靶点（PI3K/Akt/mTOR）信号通路参与异常前列腺发育。这一途径的过度激活与前列腺细胞的异常增殖有关。AR可以诱导前列腺基质细胞产生胰岛素样生长因子（IGF-1），并通过周围前列腺上皮细胞中的IGF-1R受体促进增殖。先前的研究表明，用雷帕霉素治疗的BPH患者，前列腺增生受到抑制。广泛应用于糖尿病治疗的二甲双胍，通过激活AMP活化蛋白激酶，抑制MTOR信号根据最近的研究，二甲双胍还能抑制前列腺细胞的过度生长，显示其作为治疗BPH的潜力。因此，前列腺增生症治疗不仅可以抑制AR信号,而且可以靶向IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号。

槲皮素也抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导，具有抗癌作用，抗炎，抗过敏和抗糖尿病效果。槲皮素主要以异槲皮酮（槲皮素-O-3-葡萄糖苷-槲皮素，IQ）和芸香苷（3-芦丁）的形式分布在天然植物中而不是苷元。以前的研究表明翅果连翘叶的乙醇提取物（ADLE），一种原产于韩国的植物，影响前列腺增生症。在后续研究中，使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法（UPLC-qTOF MS）分析了ADLE的代谢物，证实了IQ的高丰度（图1A-B）。然而，IQ对BPH的影响尚不清楚。因此，本文研究了IQ是否通过抑制AR信号传导和PI3K/AKT/mTOR通路来抑制BPH。

Results

UPLC-QTOF/MS测定翅果连翘叶中的化合物

用UPLC-串联MS研究了影响BPH的ADLE代谢产物（图1A-B）。ADLE富含毛蕊花甙、芦丁和IQ（图1C）。在以前的研究中，LNCaP细胞用春季和秋季收获的ADLE处理。秋季收获的ADLE对AR信号有较大的抑制作用。HPLC结果显示，秋季收获的ADLE含有IQ（20.88 mg/g）、芦丁（29.03 mg/g）和毛蕊花苷（72.16 mg/g）。而春季收获的ADLE含有IQ（12.49 mg/g）、芦丁（27.77 mg/g）和毛蕊花苷（112.46 mg/g）。

图1 ADLE的超高效液相色谱-四极杆时间-关光质谱图

IQ对BPH大鼠模型前列腺组织的影响

采用TP诱导的BPH大鼠模型确认IQ是否缓解了BPH。良性前列腺增生组的前列腺大小明显大于对照组（图2A-C）。然而，与BPH组相比，BPH组服用IQ后，前列腺体积的缩小呈浓度依赖性。与BPH组相比，前列腺的大小有所减少。根据前列腺指数，IQ低于FI，但差异不显著。BPH组经苏木精和伊红染色显示前列腺上皮细胞过度增生，管腔面积减少。相比之下，前列腺增生组的IQ抑制了上皮组织的过度增生和更大的管腔面积，与对照组的结果相似（图2D）。在前列腺中，基质是支撑上皮细胞的纤维肌基质。前列腺基质由两种不同类型的成纤维细胞和平滑肌细胞以及相互连接的胶原蛋白、蛋白多糖和细胞外基质（ECM）组成。Masson三色染色显示，平滑肌细胞为红色，胶原纤维为蓝色（图2E）。与对照组相比，BPH组前列腺纤维化，纤维结缔组织数量增加（图2E）。另一方面，当IQ治疗时，证实前列腺纤维化改善到与对照组相似的水平，这与Fi给药组相似。因此，IQ有类似的效果，Fi在BPH诱导的大鼠，并显示出浓度依赖性的改善，这表明IQ可以减轻BPH。

IQ对BPH中AR信号通路的影响

IQ对AR信号的抑制作用在大鼠组织和LNCaP细胞（一种雄激素依赖性前列腺癌细胞系）中得到证实。在大鼠BPH诱导后，5AR2、AR、SRC-1和PSA的表达增加，而IQ（1或10 mg/kg）治疗可降低其表达（图3A）。免疫组化结果显示，BPH组大鼠前列腺组织中AR的表达明显高于对照组，IQ（1或10 mg/kg）和FI给药降低（图3B）。本研究比较了ADLE（25、50和100 μg/mL）和IQ（10、25和50 μmol/L）对LNCaP细胞的影响，证实了IQ是ADLE的功能成分。采用MTT法评估了ADLE和IQ对LNCaP细胞活力的浓度依赖性影响（图3C）。IQ浓度为10 μmol/L和ADLE浓度为50 μg/mL时，细胞活力明显降低。根据MTT法的结果，高ADLE浓度为100 μg/mL，IQ为20 μmol/L。随后，研究了当TP应用于LNCaP细胞时，IQ是否抑制AR信号。LNCaP细胞经TP处理后，5AR2、AR和PSA的表达明显高于未处理组。当LNCaP细胞被ADLE和IQ处理时，5AR2、AR和PSA的表达被抑制，且呈浓度依赖性（图3D）。通过定量PCR分析代表性的AR靶基因的表达结果表明，ADLE和IQ显著抑制AR靶基因的表达（图3E）。有趣的是，IQ和ALDE抑制AR的表达，类似于AR抑制剂和恩杂鲁胺。因此，IQ干扰AR信号，结果表明，ADLE中大量包含的IQ是抑制AR信号传导的功能成分。

IQ对BPH中PI3K/AKT通路的影响

IGF-1是调节基质-上皮相互作用的主要因子，通过激活IGF-1R，通过PI3K/AKT/mTOR通路在BPH的发育中起关键作用。本文研究了IQ和ADLE是否能抑制BPH-1细胞中IGF-1处理诱导的PI3K/Akt/mTOR通路活性。为了确定合适的实验浓度，在MTT测定中确认了不同的ADLE和IQ浓度（图4A）。ADLE组细胞活力显著降低50 μg/mL，IQ组细胞活力显著降低10 μmol/L。根据MTT测定结果，在高浓度下使用ADLE（100 μg/mL）和IQ（50 μmol/L）。如图5B所示，PI3K/Akt/mTOR通路在IGF-1处理的BPH-1细胞中被激活。经IQ或ADLE处理的BPH-1细胞对IGF-1介导的PI3K/Akt/mTOR通路的激活具有浓度依赖性抑制作用。IQ下调AKT的磷酸化作用类似于LY294002（一种具有代表性的PI3K抑制剂）的作用。用免疫荧光法分析BPH-1细胞中p-AKT的表达，结果表明ADLE以浓度依赖的方式降低p-AKT的表达（图4C）。IQ也降低p-AKT表达的浓度依赖性的方式，这一结果与LY294002相似。此外，IQ抑制mTOR的磷酸化，类似于mTOR抑制剂雷帕霉素。根据这些结果，IQ和ADLE抑制了前列腺上皮细胞的PI3K/Akt/mTOR通路。

IQ对BPH增殖的影响

AR信号和通过IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路的表达细胞增殖相关因子有助于BPH的发展。IQ通过抑制AR信号传导和IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路来抑制增殖因子的表达。在BPH大鼠模型中，与对照组相比，PCNA和细胞周期蛋白D1过表达（图6A）。BPH+IQ10组PCNA和细胞周期蛋白D1的表达显著低于BPH组。本文还研究了IGF-1诱导的细胞生长因子在BPH-1细胞中的表达。与IGF-1未处理组相比，BPH-1细胞的IGF-1处理显著增加了细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、CDK2、CDK4和CDK6的表达（图5B）。与IGF-1治疗组相比，ADLE和IQ抑制细胞周期蛋白和CDK的表达。使用荧光活化细胞分选的细胞周期分析表明，IGF-1处理的BPH-1细胞降低了G0/G1期比率，增加了G2/M期比率（图5C）。与此相反，在与ADLE或IQ处理的细胞中，G0/G1期细胞的比例以浓度依赖性的方式增加，G2/M期细胞的比例下降。

IQ对前列腺增生细胞凋亡的影响

细胞增殖和凋亡之间的不平衡导致BPH。以前的实验表明，IQ抑制BPH细胞增殖。证实了在IQ处理的BPH和BPH-1细胞系中细胞凋亡相关因子的表达。在BPH诱导的大鼠中，IQ下调Bcl-2的表达，抑制了细胞凋亡，并上调了BAX的表达，BAX表达诱导了细胞凋亡（图6A）。在IGF-1处理的BPH-1细胞中，IQ以浓度依赖的方式下调Bcl-2的表达并上调Bax的表达（图6B）。ADLE对BPH-1细胞的凋亡诱导作用可能与ADLE所含的IQ有关。因此，IQ通过抑制过度增殖和诱导细胞凋亡来抑制BPH的发展。

Discussion

本研究旨在确定ADLE中与BPH大鼠前列腺减小有关的功能成分。研究结果证实，ADLE含有丰富的毛蕊花苷、芦丁和IQ（图1A-C）。此外，与春季收获的ADLE相比，秋季收获的ADLE的IQ含有大约高出两倍以上。在BPH的增生过程中，雄激素似乎激活AR信号和PI3K/Akt/mTOR通路，以刺激前列腺细胞生长增殖，并降低前列腺组织凋亡率。许多研究表明IQ抑制PI3K/Akt/mTOR通路。因此，假设IQ可以通过抑制雄激素激活的PI3K/Akt/mTOR通路来缓解BPH。结果表明IQ以浓度依赖性方式减小了BPH大鼠的前列腺大小（图2A-C）。然后研究了IQ是否抑制雄激素激活的AR信号。IQ显著降低大鼠前列腺组织和LNCaP细胞中AR信号因子的表达，与目前使用的Fi治疗方法类似（图3C）。在以前的研究中ADLE也通过有效抑制AR信号来减少前列腺的大小。发现在ADLE中含有丰富的IQ抑制AR信号，这表明IQ是ADLE的一种功能成分，并影响BPH。

此外，高血IGF-1水平，以及相对较低的血液睾酮水平与衰老相关的性激素失衡，似乎加速了糖尿病和肥胖者的BPH发病。BPH也与代谢综合征相关。作为代表性的例子，有代谢综合征的BPH患者的前列腺年增长率明显高于无代谢综合症的患者。其机制可能与引起代谢综合征和主要内分泌异常的高胰岛素血症有关，并且被认为是由于IGF-1介导的胰岛素对细胞增殖和胰岛素的抗凋亡作用所致。IGF-1的表达通过AR信号途径增加，通过激活IGF-1介导的PI3K/AKT/mTOR信号途径触发细胞生长和增殖。因此，抑制IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR通路的药物可能对BPH有效。这种效应可能会扩大目前的BPH治疗方案的选择。因此，研究了BPH-1细胞中PI3K/AKT/mTOR通路的激活以及ADLE和IQ在IGF-1处理后是否有效地抑制了这一机制。ADLE和IQ以浓度依赖的方式抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，类似于PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂雷帕霉素。先前的一项研究表明，雷帕霉素的给药在临床上可有效减少BPH患者的前列腺大小。由于IQ抑制PI3K/AKT/mTOR通路，细胞周期蛋白的表达显著降低，细胞停滞在G0/G1期（图5C）。相反，IQ通过降低Bcl-2的表达和增加TP诱导的BPH大鼠模型和BPH-1细胞中Bax的表达来诱导细胞凋亡。因此，结果表明，IQ抑制雄激素诱导的AR信号激活，IGF-1诱导PI3K/Akt/mTOR通路激活，从而抑制细胞增殖，提高细胞凋亡率。

雷帕霉素诱导自噬，延缓衰老，并显示出对癌症以及代谢性疾病（如2型糖尿病和心血管疾病）的疗效。因此，激活自噬的药物可能缓解BPH。此外，IQ在多个癌细胞中诱导自噬，并诱导自噬性凋亡。BPH还激活自噬抑制细胞增殖和增加细胞死亡率。然而，目前尚不清楚IQ是否在体内和体外能诱导自噬并抑制PI3K/Akt/mTOR通路。需要进一步的研究来探讨BPH中IQ的自噬诱导活性。

相比之下，几项研究报告称，使用槲皮素作为配基的IQ表现出比槲皮素更高的吸收率。槲皮素仅通过被动转运吸收，而IQ不仅以糖苷形式吸收，而且以槲皮素形式被肠上皮细胞分泌的乳糖酶-根皮苷水解酶吸收。因此，尽管IQ具有与槲皮素相似的功效，但它在许多组织中比槲皮素更具生物利用度，表明它在较低浓度下的效果比槲皮素更大。然而，没有比较槲皮素和IQ在前列腺中的生物利用度和功效的差异；因此，槲皮素和IQ对BPH的影响是否存在机制差异尚不清楚，需要进一步研究。此外，尚不清楚槲皮素及其葡萄糖苷、IQ和芦丁对BPH的影响是否存在机制差异。因此，还应比较槲皮素、IQ和芦丁在BPH中的活性。综上所述，IQ在BPH大鼠模型中有效减小了前列腺大小，并在体外有效抑制了AR信号传导和PI3K/AKT/mTOR通路，表明其作为BPH治疗的潜力。

Alleviatory effect of isoquercetin on benign prostatic hyperplasia via IGF-1/PI3K/Akt/mTOR pathway

Young-Jin Choia,b,c, Meiqi Fand, Nishala Erandi Wedamullaa,b,c,e, Yujiao Tangf, Eun-Kyung Kimg,h,*

a Department of Food Science and Nutrition, Dong-A University, Busan 49315, Republic of Korea

b Center for Silver-targeted Biomaterials, Brain Busan 21 Plus program, Dong-A University, Busan 49315, Republic of Korea

c Department of Health Sciences, the Graduate School of Dong-A University, Busan 49315, Republic of Korea

d Division of Food Bioscience, College of Biomedical and Health Sciences, Konkuk University, Chungju 27478, Republic of Korea

e Department of Export Agriculture, Faculty of Animal Science and Export Agriculture, Uva Wellassa University, Badulla 90000, Sri Lanka

f School of Bio-Science and Food Engineering, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130600, China

g Nutritional Education Major, Graduate School of Education, Dong-A University, Busan 49315, Republic of Korea

h Nutrinomics Lab. Co., Ltd., Busan 49315, Republic of Korea

*Corresponding author.

Abstract

We evaluated the effect of isoquercetin (quercetin-O-3-glucoside-quercetin, IQ) as a functional component of Abeliophyllum disistichum Nakai ethanol extract (ADLE) on prostate cell proliferation and apoptosis and its effects on the IGF-1/PI3K/Akt/mTOR pathway in benign prostatic hyperplasia (BPH). Metabolites in ADLE were analyzed using UHPLC-qTOF-MS and HPLC. IQ was orally administered (1 or 10 mg/kg) to a testosterone propionate-induced BPH rat model, and its effects on the prostate weight were evaluated. The effect of IQ on androgen receptor (AR) signaling was analyzed in LNCaP cells. Whether IGF-1 and IQ affect the IGF-1/PI3K/Akt/mTOR pathway in BPH-1 cells was also examined. The metabolites in ADLE were identified and quantified, which confirmed that ADLE contained abundant IQ (20.88 mg/g). IQ significantly reduced the prostate size in a concentration-dependent manner in a BPH rat model, and significantly decreased the expression of AR signaling factors in the rat prostate tissue and LNCaP cells in a concentration-dependent manner. IQ also inhibited the PI3K/AKT/mTOR pathway activated by IGF-1 treatment in BPH-1 cells. In BPH-1 cells, IQ led to G0/G1 arrest and suppressed the expression of proliferation factors while inducing apoptosis. Thus, IQ shows potential for use as a pharmaceutical and nutraceutical for BPH.

Reference:

CHOI Y J, FAN M Q, WEDAMULLA N E, et al. Alleviatory effect of isoquercetin on benign prostatic hyperplasia via IGF-1/PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(3): 1698-1710. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250216.

翻译：罗敬（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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