北理工团队在生物法合成天然产物糖苷类药物领域取得重要进展

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导读

三萜化合物是一类重要的植物天然产物，因其独特的药理活性而受到广泛关注。然而，由于分子中的疏水碳环结构，三萜化合物普遍存在溶解度低和生物利用度差的问题。糖基修饰可显著改善三萜化合物的水溶性，因此三萜化合物多以糖苷的形式存在。其中，直链三糖基修饰是一种重要的糖基修饰类型，对发挥三萜化合物独特的药理活性具有重要意义。相较于化学合成法，利用酶法合成三萜糖苷化合物具有反应条件温和、定向催化和环境友好等优势，特别是在合成具有复杂多糖基修饰的三萜糖苷化合物时，酶法可避免化学合成法中繁杂的基团保护与去保护过程。尿苷二磷酸-糖基转移酶（uridine diphosphate glycosyltransferases，UGTs）是催化天然产物糖基修饰的主要生物催化剂，在目前已报道的UGTs中，大多仅催化三萜单糖苷和二糖苷的合成，具有直链三糖基修饰催化活性的UGTs数量极少，限制了三萜直链三糖苷的酶法合成。此外，该类型UGTs的催化功能特点和底物特异性的分子机制也不清晰。针对以上问题，本研究通过生物信息学分析、结合体外酶学性质表征系统发掘可催化合成三萜直链三糖苷的UGTs，并揭示该类型UGTs催化底物的结构特点，通过祖先酶序列重构、氨基酸突变和计算机模拟等手段阐明其底物特异性的分子机制。相关研究成果以“Engineering the Substrate Specificity of UDP-Glycosyltransferases for Synthesizing Triterpenoid Glycosides with a Linear Trisaccharide as Aided by Ancestral Sequence Reconstruction”为题目在国际知名期刊Angewante Chemie International Edition上发表（DOI: /10.1002/anie.202409867）。北京理工大学化学与化工学院博士研究生简行为该论文的第一作者，清华大学李春教授与北京理工大学化学与化工学院长聘副教授冯旭东为该论文的共同通讯作者。

本研究首先对7个UGT91H亚家族酶进行系统性表征，结果表明7个UGTs对14个三萜化合物有催化活性，特异性的在其C2 '' -OH修饰一分子糖基，成功合成26个三萜直链三糖苷。揭示了7个UGT91H亚家族酶催化糖基受体底物的结构特点：仅可催化在C3-OH修饰二糖基且第一个糖基为葡萄糖醛酸基或葡萄糖基的三萜化合物，而对三萜苷元或三萜单糖苷则没有催化活性。另外，7个UGTs对UDP-糖基供体具有较为严格的特异性，对UDP-鼠李糖（UDP-Rha）具有最高的偏好性，对UDP-木糖（UDP-Xyl）次之，而对其他UDP-糖供体则没有催化活性。

利用祖先酶序列重构技术获得UGT91H亚家族的祖先酶UGT91H_A1， 其在保留UGT91H亚家族现代酶直链三糖基修饰功能外，表现出了更广的底物谱和更高的活性。在糖基受体方面，UGT91H_A1可催化17个三萜化合物修饰一分子糖基。在糖基供体方面，除UDP-Rha和 UDP-Xyl之外，UGT91H_A1还具有高效利用UDP-葡萄糖（UDP-Glc）的活性。最后利用UGT91H_A1成功合成了 33个三萜直链三糖苷。

进一步阐明了UGT91H_A1中非保守的RTAS Loop对UGT91H亚家族酶的底物特异性具有重要影响。将RTAS Loop替换至UGT91H8 和UGT91H7对应区域，分别获得突变体UGT91H_6mu和UGT91H7M，均具有催化新底物α-常春藤苷（17）糖基修饰的活性。分子动力学模拟和量子力学计算表明，RTAS Loop通过影响酶和底物的相互作用和结合能来调控酶的底物特异性。

针对糖基供体UDP-Rha成本高的问题，构建了包括蔗糖合酶 Gu SUS1-Δ9、UDP-Rha 合酶 At RHM2和双功能鼠李糖合酶 At NRS/ER的三酶级联体系，实现了以廉价的蔗糖为原料合成UDP-Rha。将该体系与UGT91H_A1偶联的四酶体系（分步法）降低了甘草次酸 3- O -GlcA-Gal-Rha（2a）和常春藤皂苷元 3- O -Ara-Rha-Rha（17a）的合成成本，底物转化率分别达到80.1 ± 0.3%和61.3 ± 4.1%。

以上述表征的UGT91H亚家族酶的序列为探针，建立了基于进化分析的快速酶挖掘方法，对NCBI数据库中8种豆科植物基因组进行系统分析和挖掘，共获得23个候选酶，最终证实19个为UGT91H亚家族酶，大大提高了酶挖掘的效率和准确性。从中挑选了PNY09112.1、GAU40116.1和PNX78912.1进行功能表征，均表现出对三萜化合物C2 '' -OH特异性修饰一分子鼠李糖基或木糖基的活性。此外，GAU40116.1和PNY09112.1还对UDP-Gal具有微弱的新活性。

本研究系统探索了UGT91H亚家族酶的催化功能特点，并利用祖先酶重构技术拓展了该亚家族酶的底物谱，实现23个新型三萜直链三糖苷的酶法合成。鉴定了影响UGT91H_A1底物特异性的关键区域RTAS Loop，并通过对UGT91H亚家族酶中RTAS Loop相应区域的突变，实现了该亚家族酶底物特异性的调控。还开发了基于进化分析的UGT91H亚家族酶的快速挖掘方法。本研究为进一步拓展三萜化合物更多酶法糖基化修饰类型提供了新思路和新方法。

来源：北京理工大学