伦敦大学学院宋文辉教授团队 Small：揭示纳米液晶结构引导有序矿化骨再生

随着全球对骨移植需求的不断增加，人工骨的研究已经成为骨组织工程和骨缺损修复的一个重要领域。尽管当前在仿生骨材料和器件的研究开发取得了一定进展，但在宏观尺度上实现连续有序矿化结构的再生技术仍然十分有限。骨组织卓越的机械性能源于其从纳米到宏观的高度有序复合结构，其中纳米尺度I型胶原蛋白纤维与羟基磷灰石（HAp）纳米晶片复合的液晶态有序排列结构就起到重要的基石作用。液晶是一种介于液态和固态之间的中间相态，其分子或纳米结构排列具有固态的低维度长程有序性，同时又具有液体的流动性。有证据表明，许多生物器官和组织的特征都与液晶态相关。致密骨就具有典型的液晶态长程有序结构，I型胶原大分子在骨组织中自组装成高度取向的纤维束结构，HAp纳米晶片则有序地填充在胶原纤维束间隙中，矿化胶原纤维束连续取向紧密排列呈同心环状。这种长程有序的液晶态纳米复合结构也是骨再生所依赖的模板， 然而致密骨自主装液晶结构的形成以及如何引导定向有序的骨再生的机制仍不完全清楚。

2024年8月23日，伦敦大学学院（UCL）外科重建与再生生物材料中心主任宋文辉教授团队在《Small》期刊上发表了题为“ Liquid Crystalline Hydroxyapatite Nanorods Orchestrate Hierarchical Bone‐Like Mineralization ”研究论文。该研究创新性地结合纳米材料科学与生物工程技术，利用HAp纳米棒取向液晶态结构为基板，系统研究了人类骨髓间充质干细胞（hBMSCs）在成骨分化过程中的有序矿化现象，首次深入揭示了HAp纳米棒液晶态结构和取向度在增强成骨分化和引导多尺度有序矿化中的关键性作用及其潜在的分子机制。

研究团队首先设计并合成了具有荧光标记的高长径比HAp纳米棒，使其水胶体中自主装形成各向异性的液晶相，接着使用旋涂技术将HAp纳米棒制备成宏观尺度的单向取向有序结构。为了验证HA纳米棒液晶态结构在生物系统中的作用，研究团队将hBMSCs播种在单向取向HAp液晶薄膜上，并进行了28天的成骨分化培养。实验结果显示，在HAp单向取向液晶结构上培养的hBMSCs会沿HAp纳米棒取向方向生长并拉长，同时增加成骨基因表达，并产生相同取向的类似天然骨中的细胞外基质（ECM）和矿化产物。透射电镜（TEM）结合电子衍射、X线衍射和原子力显微镜（AFM）揭示了矿化产物均匀细密的纳米晶片结构，这些纳米晶片有序排列成类似于天然骨中的层状结构。小角X光散射（SAXS）进一步确认了这些板层结构在大尺度基板上的取向性，显示出矿化产物具有宏观长程有序的排列。这些矿化物具有良好的晶体结构，与天然骨的矿物成分相似。拉曼光谱分析进一步确认了矿化物中的磷酸盐基团，提供了化学成分的证据。此外，RNA测序分析揭示了COL1A1和COL4A6基因在调控ECM有序排列中的关键作用，并且证明PI3K-Akt信号通路的激活进一步促进了这一有序化过程。这些系统表征结果显示，液晶态HAp纳米棒不仅能够诱导hBMSCs生成高度有序的钙沉积物，还能够在分子到宏观的多尺度上保持这种有序结构。

这项研究系统地揭示了HAp纳米棒结晶态结构在从分子到宏观尺度上引导有序矿化的关键机制，不仅为理解骨组织再生和其它组织钙化提供了新的理论基础，也为仿生人工骨材料的设计与应用提供了全新的思路。这些发现有望推动骨组织工程和再生医学的进一步发展。

图1.液晶态HAp纳米棒的合成和表征。A) 低倍 STEM 图像（比例尺 = 100 nm）和 B) 合成和商业 HAp 纳米粒子的 XRD 光谱。C) HAp 纳米棒的激发/发射光谱的 3D 瀑布图。340 nm的激发波长激发最高的发射峰。放大图显示，在常用的 488 nm激发波长下，545、588 和 621 nm 处的铽离子峰仍然可被识别。D) 液晶 HAp 水胶体的形成。E)毛细管中 HAp 胶体的 SAXS（左）和 WAXS（右）的 1D 光谱和 2D衍射图案。除了HAp纳米棒晶体结构的高 q 值处的衍射尖峰外，低 q 值处未出现对应低维有序结构的衍射峰，证明液晶 HAp 水胶体呈现向列相。

图2.控制液晶态HAp纳米棒的取向度和细胞响应。A) HAp纳米棒胶体 (17.4 wt.%)在密封比色皿中随时间生长的双折射域。B) 具有多向和单向取向 (1 – 3)的液晶态HAp纳米棒的正交偏振视图和补偿视图。(4–6) 在低放大倍数下；(7–9) 高放大倍数。补偿器 (1/4λ 波长，红色箭头)与检偏器成45°。C) HAp纳米棒多向取向液晶态结构的FE-SEM 图像。虚线突出显示了典型的 +1/2 (红色) 和 −1 (绿色) 向错。比例尺 = 2 µm。D) HAp纳米棒单向取向液晶态结构的 FE-SEM 图像。红色箭头表示排列方向。左角的插图显示旋涂过程中惯性 (离心) 力 I (绿色) 和惯性 (切向) 力 II (蓝色) 作用下的HAp纳米棒的排列方向 (红色)。比例尺 = 2 µm。E) hBMSCs 在 HAp 基板上增殖的代谢活性。F) hBMSCs释放到培养基中的腺苷酸激酶 (AK) 浓度。G) hBMSCs 的DNA总值。所有数据均是细胞增殖的第 1、3 和 7 天记录。E)和F)中的条形图和左侧 y 轴表示与对照组相比的相对变化百分比，而折线图和右侧y轴表示每mg DNA的平均值。每项条件n = 3。统计分析：单因素方差分析。*：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001。

图3. 液晶HAp纳米棒引导 hBMSCs成骨分化。上方茜素红 S 染色指示对照组矿化产物增加，代表hBMSCs成骨分化进程。圆形盖玻片直径 = 9 毫米。A) 不同 HAp 基板上培养的 hBMSCs在第 1、7、14、21 和 28 天成骨分化过程中的 ALP 活性。条形图和左侧 y 轴表示与对照组相比的相对变化百分比，而折线图和右侧y轴表示绝对值。B-D)不同HAp 基板上培养的 hBMSCs 在第 7、14、21 和 28 天成骨分化过程中的OCN、ALP 和 RUNX2 基因表达。每种条件n = 3。统计分析：单因素方差分析。*：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001。E) hBMSCs 在不同 HAp基板上第28 天时骨桥蛋白表达(OPN 染色为绿色)和矿化产物(用OsteoSense 680EX 染色，光谱从红色到黑色) 的共聚焦显微镜图像。使用 63 倍油镜拍摄。比例尺 = 30 µm。F)不同 HAp 基板上成骨0 天和 28 天时 hBMSCs 和 ECM 的多光子显微镜图像。在单向取向 HAp 组中观察到高度取向的 ECM。红色：ECM；蓝色：细胞核；绿色：F-肌动蛋白。比例尺 = 50 µm。

图4.矿化产物多尺度有序结构表征。A)HAp液晶基板和hBMSC在基板上成骨分化第 14 和 28 天的场发射扫描电子显微形态图 (FE-SEM)。比例尺 = 1 µm。B) hBMSCs在基板上成骨分化第 0、14 和 28 天的密度相关彩色扫描电子显微图(DDC-SEM)显示hBMSC 拉长形态 (绿色) 并逐渐增加（PDMS基板为对照组），致密矿化产物(红色)也逐渐覆盖在细胞和基板上。比例尺 = 10 µm。C) HAp单向取向基板和hBMSCs在基板上成骨分化第28天的AFM相位和损耗角正切图像 (比例尺 = 200 nm)，D) XRD 光谱 (第 0 和第 28 天)，以及 E)多向和单向取向HAp 组成骨分化 (第 28 天) 中的 SAXS 2D 图案和矿化产物分析。①和②SAXS二维衍射图样和对应的一维方位角图。白色箭头表示q范围（q = 0.01 Å−1至 0.05 Å−1）。上部示意图显示样品垂直于入射X射线束。一维方位角图中，黑色曲线：多向取向HAp组；红色曲线：单向取向HAp组；绿色区域为A0，即基线以下的区域；蓝色区域为A1，即基线以上区域。

图5.hBMSC-HAp液晶态结构相互作用及其潜在的分子机制分析。A) 中心基因和信号通路的维恩图显示COL1A1 和 COL4A6 参与了所有 3 条富集通路。B) hBMSC成骨分化第 14 天接受不同处理后的 DNA总值和C)平均 ALP 活性。D) 接受不同处理后的 hBMSC形态的荧光显微镜图像。蓝色：细胞核；红色：F-肌动蛋白。比例尺 = 100 µm。E) 成骨分化第21 天， COL1A1、COL4A6、PI3K、磷酸化 PI3K (p-PI3K)、Akt、磷酸化 Akt(p-Akt) 和GAPDH 的蛋白质印迹。每种条件n = 3。统计分析：单因素方差分析。*：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001。

图6.HAp纳米棒液晶态取向结构引导的有序矿化和相关分子机制概要。A) HAp纳米棒单向取向液晶结构引导有序矿化示意图1) HAp纳米棒合成并在剪切力辅助下制作宏观尺度上取向排列仿生液晶态结构；2) 将 hBMSCs 接种于其上并进行成骨分化；3) hBMSCs呈现拉长生长并产生与HAp基板相同取向排列的 ECM， 4) 在分化第 14 天前后，hBMSCs定向诱导分化成长形取向的前成骨细胞；5)逐渐成熟的成骨细胞诱导产生并沉积有序取向的钙纳米晶片。B)HAp纳米棒单向取向液晶态结构诱导的有序矿化信号通路示意图是由以下几个步骤级联信号组成：① hBMSCs 通过局灶性复合物附着、感知和识别单向取向 HAp 纳米棒；②拓扑信息传递到细胞核中，激活中心基因 COL1A1 和 COL4A6 的表达；③以单向取向 HAp为主要模板，定向产生 ECM，并导致 hBMSCs 伸长；④由于伸长，F-actin 的张力增加，⑤激活 PI3k-Akt 信号通路；⑥上调成骨基因 ALP、OCN 和 RUNX2 的表达；⑦以取向的 ECM 为次要模板，引导沉积有序的钙纳米晶片。

论文第一作者是博士生陈基施展。通讯作者为宋文辉教授。此研究得到英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）基金支持，并在第43届国际矫形与创伤外科学会（SICOT）世界骨科大会中获Shimomura/OREF/SICOT Travel奖。

https://doi.org/10.1002/smll.202310024

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