Plant Physiol | 东北师范大学高翔团队解析月季萜类花香物质的合成通路

玫瑰醇是蔷薇属植物特征的花香成分，是香叶醇和香茅醇的统称，在众多园艺作物中广泛存在，影响了园艺作物的香气等品质性状。月季是世界知名花卉作物，然而其驯化过程中香气呈现出了明显的丢失趋势，解析芳香月季品种特征香气成分的合成通路，并进行香气通路的重构，是进行芳香月季分子育种的前提。

近日，东北师范大学高翔教授团队联合国际国内多个研究单位在Plant Physiology发表了题为“The Complexity of Volatile Terpene Biosynthesis in Roses: Particular Insights into β-Citronellol Production”的研究论文，系统解析了月季萜类花香物质的合成通路。

本研究的主要发现如下：

1.对20种代表性古老和现代月季进行了花香成分鉴定，发现香叶醇、柠檬醛、香茅醇等香叶醇衍生物的协同释放规律，暗示这些物质可能在同一个代谢通路里被合成；此外，该研究还详细分析了香叶醇及其衍生物以外的其他的挥发性萜类物质（包括单萜、倍半萜和类胡萝卜素裂解产物）在品种间的种类和含量的差异，其中倍半萜和玫瑰醇的含量显著高于其他挥发性萜类物质。

图1：古老和现代月季品种花香释放规律

2.以现代四倍体月季‘红双喜’为研究对象，鉴定了挥发性萜类物质直接前体物质异戊烯基焦磷酸及香叶醇和法呢醇的直接前体物质异戊烯基单磷酸的含量。分析了萜类物质合成上游MVA和MEP途径相关基因的表达模式及其编码蛋白的亚细胞定位。研究发现：MVA途径的相关基因整体表达量高于MEP途径的相关基因，而且相关基因编码蛋白分别定位于细胞质和质体，暗示：MVA途径在月季挥发性萜类香气物质前体物质供应中发挥了更重要的作用。为了阐释萜类物质直接前体物质异戊烯基焦磷酸GPP和(E, E)-FPP的生物合成机制，对现代月季的异戊烯基焦磷酸转移酶（PTs）基因家族进行了系统的鉴定和功能解析，整合基因表达模式、酶学催化活性和植物体内功能验证，发现：细胞质是萜类物质直接前体物质异戊烯基焦磷酸GPP和(E, E)-FPP合成的主要亚细胞区间，分别由细胞质定位的RhG/FPPS1和RhFPPS2控制；相对而言，质体定位的RhGPPS及RhGGPPS合成GPP的能力较弱。这与近期报道的二倍体古老月季中的发现基本一致（Conart et al., 2023）。2015年，本论文共同作者Sylvie Baudino教授团队发现：月季香叶醇的合成由定位于细胞质的NUDX1-1a催化合成，是一个新的区别于萜类合酶（TPS）催化的合成途径，相关结果以封面论文的形式发表于Science期刊上(Magnard et al., 2015)。该研究结果再次证明了细胞质区间对于蔷薇属植物，尤其是现代月季挥发性萜类物质前体物质合成的重要贡献，并进一步解释了为何月季中除了香叶醇及其衍生物以外其他单萜物质的释放量较低，而且倍半萜的含量大都高于单萜的原因。

图2：现代月季‘红双喜’异戊烯基焦磷酸转移酶（PTs）功能鉴定

3.由于其他物种香叶醇的合成都是由萜类合酶（TPS）催化的，而且NUDX1-1a被发现之前只有一条月季TPS的功能被鉴定（催化产生大根香叶烯），之后也只有两条TPS的功能被解析（催化产生芳樟醇和橙花叔醇），虽然这三条TPS都不能催化产生香叶醇，但是TPS家族成员众多，少量的序列变异也可以导致TPS催化产物的变化，因此，无法排除其他TPS可以催化产生香叶醇的可能，此外，除了大根香叶烯、芳樟醇和橙花叔醇以外，月季其他单萜和倍半萜物质如何被TPS催化合成在论文接收前鲜有报道。本论文的研究发现：‘红双喜’花中高表达的11条TPS基因编码的蛋白并不能合成香叶醇，而本氏烟草中单转‘红双喜’RhNUDX1-1a可以检测到香叶醇的释放，进一步证明了月季NUDX1-1a对于香叶醇合成的重要性。虽然TPS并不能催化产生香叶醇，但是他们可以催化产生香叶醇以外的其他的单萜和倍半萜物质。近期玫瑰花香的研究也有类似的发现（Shan et al., 2024）。此外，TPS亚细胞定位、体外酶活和植物体内的功能鉴定结果发现：定位于质体的TPS大都丧失了在植物体内合成单萜的能力，这可能是月季进化出一条依赖于细胞质区间合成香叶醇等单萜物质的结果或者原因。

图3：现代月季‘红双喜’花中高表达的萜类合酶基因（TPS）功能鉴定

4.根据前人的报道和香叶醇、香茅醇及其衍生物的分子结构，推测了三条香叶醇到香茅醇转化的潜在途径。由于花瓣中并未检测到香茅基焦磷酸或者单磷酸的存在，结合花瓣蛋白粗提物质和一系列的底物及中间产物的反应的时序关系，基本确定了月季香叶醇到香茅醇的转化由三步反应完成。围绕MDR, SDR和OYE等三个大的基因家族，通过系统的体外酶活、酶促动力学参数、亚细胞定位和基因表达模式分析，筛到到了 24 条具有催活性的酶 (包括 4 GeDHs, 3 GERs, 12 CARs 和 5 OPRs)。其中RhGeDH1, RhGER2, RhOPR1和RhCAR2是主要的成员。GeDH1催化香叶醇到柠檬醛，香茅醛到香茅醇的转化及相对较弱的香茅醇到香茅醛的反应；RhGER1和RhOPR1催化柠檬醛到香茅醛的转化，其中RhGER1对柠檬醛的底物结合能力和催化效率更高。RhCAR2也可以催化香茅醛到香茅醇的转化。多拷贝的RhCAR和RhGeDH都可以催化该步转化反应，可以解释为何月季花香中检测不到香茅醛的释放的原因。

图4：香叶醇到香茅醇的生物转化

5.为了检测香叶醇到香茅醇转化通路中的主要的RhGeDH1, RhGER2, RhOPR1和RhCAR2等基因在植物体内的功能，利用本氏烟草叶片瞬时表达技术，单独或者多基因聚合共表达技术进行遗传转化，发现：当RhNUDX1-1a与上述基因共表达的时候可以检测到香叶醇，香茅醇及其衍生物，且RhNUDX1-1a与RhGeDH1, RhGER2/RhOPR1和RhCAR2共表达时，香茅醇的释放比例最高，再次证明了香叶醇到香茅醇的三步催化反应。为了进行花香育种的改良，将上述基因在检测不到香叶醇和香茅醇释放的知名月季品种‘果汁阳台’的花瓣中瞬时表达，发现：单转RhNUDX1-1a和RhG/FPPS1共转时，都未检测到香叶醇、香茅醇及其衍生物的产生，原因是‘果汁阳台’的花瓣中检测不到RhNUDX1-1a的底物GPP，而且RhNUDX1-1a的表达量仅仅是‘红双喜’的1/60。当花瓣中饲喂了香叶醇等底物以后，相关催化产物都可以检测到，初步实现了通过对不能释放香叶醇、香茅醇及其衍生物的月季品种进行改造，使之合成和释放相关花香物质，为芳香月季的育种奠定了基础。

图5：月季花瓣和烟草叶片的香茅醇通路重构

6.由于香叶醇、香茅醇及其衍生物是柑橘、葡萄、荔枝、芍药/牡丹、紫薇等多种园艺作物主要的香气成分，本论文进一步以芍药和紫薇为材料，验证了上述香叶醇到香茅醇转化的三步反应中相关基因功能的保守性，为园艺作物的香气育种提供了基因资源。

图6：香茅醇合成通路功能保守性分析

综上，该研究对月季挥发性萜类物质的种类、底物来源、生物催化（TPS和NUDX1-1a）、以及香叶醇到香茅醇的转化进行了系统的鉴定。共涉及到70多个基因的克隆、表达和亚细胞定位，50多个基因编码蛋白的体外酶活和体内功能鉴定，4个主要基因的酶促到力学分析和多基因聚合表达。该研究相对完整地解析了月季挥发性物质的生物合成途径的全貌，并实现了通过多基因聚合技术合成相关香气物质的目标。同时证明了香叶醇到香茅醇转化通路的保守性。因此，该研究对未来园艺作物的香气育种具有一定的参考价值。由于挥发性萜类物质的广泛用途，本论文将来有可能会引起农学、生物学、园艺学、药用植物、合成生物学、香水和化妆品领域等领域读者的关注。

图7：现代月季‘红双喜’萜类花香物质通路解析

东北师范大学在读博士李宏杰，李月庆副教授，云南省农业科学院花卉研究所晏慧君研究员为本论文共同第一作者，高翔教授为该论文通讯作者。法国圣埃蒂安大学Jean-Claude Caissard, Benoît Boachon, Sylvie Baudino在实验设计、论文写作和数据分析方面提供了帮助，浙江大学张亮生教授团队为本研究提供了月季‘红双喜’品种的基因组信息，北京林业大学蔡明副教授为本研究提供了紫薇转录组数据和样品，华中农业大学宁国贵教授参与了数据分析和论文写作讨论。该研究得到了国家自然科学基金、云南省自然科学基金等项目经费的支持。

主要参考文献：

Hongjie L, Yueqing L, Huijun Y, Tingting B, Xiaotong S, Jean-Claude C, Liangsheng Z, Huiyi F, Xue B, Jia Z, et al. The Complexity of Volatile Terpene Biosynthesis in Roses: Particular Insights into β-Citronellol Production. Plant Physiol. 2024, https://doi.org/10.1093/plphys/kiae444

Magnard JL, Roccia A, Caissard JC, Vergne P, Sun P, Hecquet R, Dubois A, Oyant LHS, Jullien F, et al. PLANT VOLATILES. Biosynthesis of monoterpene scent compounds in roses. Science 2015:349(6243):81-83. https://doi.org/10.1126/science.aab0696

Conart C, Bomzan DP, Huang XQ, Bassard JE, Paramita SN, Saint-Marcoux D, Rius-Bony A, Hivert G, Anchisi A, Schaller H, et al. A cytosolic bifunctional geranyl/farnesyl diphosphate synthase provides MVA-derived GPP for geraniol biosynthesis in rose flowers. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023:120(19):e2221440120. https://doi.org/10.1073/pnas.2221440120

Junzhong S, Dedang F, Heng L, Lintao N, Runhui L, Yajun L, Mengxi Chen, Ao L, Zhenhua L, Yanhong H, et al. Evolution of the biosynthetic pathways of terpene scent compounds in roses. Curr Biol. 2024:5;34(15):3550-3563.e8. https://doi: 10.1016/j.cub.2024.06.075.

论文链接：

https://doi.org/10.1093/plphys/kiae444