Nat Chem Biol | 李晗团队利用正交辅因子实现氧化还原平衡的调控

相比传统的化学合成，合成生物学有巨大的潜力用于制造重要的化学品。然而在改造宿主生物途径的过程中，氧化还原不平衡是其中一个关键的问题，会导致产物产率低，无法实现工业化生产。在生物体内，合成代谢途径是由天然氧化还原反应辅因子NAD+和NADP+介导，这导致生物合成途径之间存在竞争性，影响目标产物的产量。因此，引入体内正交且经济的辅因子有望实现代谢途径的精细调控，使目标产物产率最大化。李晗团队在前期的研究中鉴定了正交辅因子NMN+以及可利用该辅因子的酶GDH ortho (详见BioArt报道：) ，并且验证了该正交系统在生物合成中的应用 (Richardson et.al., 2020) 。

近日，李晗团队在Nature Chemical Biology上发表了文章Shifting redox reaction equilibria on demand using an orthogonal redox cofactor。基于NMN+，该团队通过一个高通量的生长进化平台对乳酸乳杆菌氧化酶Nox进行改造，得到了一个正交氧化酶Nox Ortho,与之前鉴定的GDH Ortho组合，NMN(H)的氧化还原比例 (NMNH/NMN+) 可以控制在70-0.07之间，在体外和体内均正交于天然辅因子NAD(H)和NADP(H)。通过改造得到正交利用NMN(H)来专一合成(S)-丁二醇的脱氢酶BDH，该团队在体内和体外利用该正交系统实现了光学纯2，3-丁二醇的高效合成。针对Nox Ortho的定向进化设计原则也通用于其他六个丁二醇脱氢酶，使其偏好利用正交辅因子NMN(H)。

丁二醇作为重要的手性化学品，有广泛的用途，如橡胶，燃料及药品。丁二醇有3种立体异构体：(2S,3R)-内消旋丁二醇(m-BDO), (2S,3S)-丁二醇 ((SS)-BDO)以及 (2R,3R)-丁二醇 ((RR)-BDO)。该研究工作试图借助正交辅因子实现m-BDO到(SS)-BDO或(RR)-BDO的转化，这需要通过两步反应实现，m-BDO被氧化生成中间体3-羟基丁酮，随后被还原生成相应的丁二醇。当体系内没有引入辅因子循环体系，只有NAD(H)和不同手性偏好的丁二醇脱氢酶存在时，产物是m-BDO、(SS)-BDO及(RR)-BDO的混合物。将氧化NADH的乳酸乳杆菌氧化酶Nox引入体系中，NADH/NAD+比例变低，反应积累3-羟基丁酮。然而，将可以还原NAD+为NADH的枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶引入反应体系中时，NADH/NAD+比例变高，底物m-BDO并没有被消耗。通常解决这种问题有两种方法：1）将氧化反应和还原反应进行区域化，分别调控NADH/NAD+的比例来调控反应；2）引入NADPH作为还原力，NAD+作为氧化力。然而区域化对于中间体的扩散有比较高的要求，并且大部分酶对NADH和NADPH没有特别好的专一性，因此该团队设想引入第三个正交辅因子NMN(H)，并通过改造丁二醇脱氢酶来使用该辅因子可以解决该问题。

由于此前该团队已经构建了能维持高NMNH/NMN+的酶GDH Ortho，他们着手于改造能维持低NMNH/NMN+的正交酶。通过定点突变，他们得到了对NMNH活性提高20倍的突变体Ll Nox I159T，为了进一步提高对NMNH的活性，他们借助生长选择平台进行酶改造。经过筛选，他们得到一个突变体Ll Nox I159T;D178N;A179F;I243E (Nox Ortho)，对NMNH的催化效率提高了250倍左右，与野生型相比，NADH催化效率降低了100倍。同时，突变体和野生型对NADPH的活性也很低。计算模型发现I159T相比于野生型，与NMNH形成了新的极性作用力，D178N和I243E形成了新的氢健。A179F可能限制了D178N的构象，使其更倾向于和I243E形成氢健，而该氢健使NADH偏离原本的结合口袋，偏向溶剂。

采用Nox Ortho类似的设计原则，他们得到了突变体Kp m-Bdh Ortho(M189T;Y34Q;A87K)，对NMN+的活性相比于野生型提高了19倍，对NAD+和NADP+的催化效率分别降低了160000及70倍。Kp m-Bdh Ortho催化m-BDO与(R)-3-羟基丁酮间的转化。由于该工作需要一个能利用NMNH的以（S）-3-羟基丁酮为底物的酶，他们对6个丁二醇脱氢酶进行改造，突变体均有正交性，然而只有Ser Bdh Ortho (L39Q;A92K;M194T) 可以将(S)-3-羟基丁酮转化为(SS)-BDO。

在得到利用NMNH的酶后，他们首先在体外用纯蛋白进行NADH/NMNH系统在丁二醇转化中的测试。当野生型Lb NOX、枯草芽孢杆菌(R)-Bdh、GDH Ortho以及Ser Bdh Ortho存在时，5g/L的m-BDO被转化为3.8g/L的(SS)-BDO，NMNH:NMN+比例为3.7 ± 0.2，NADH:NAD+比例为0.10 ± 0.03。当体系中含有Nox Ortho、Kp m-Bdh Ortho、GDH WT 以及 Bs (R)-Bdh时, 2 g/L m-BDO 被转化为1.6 g/L (RR)-BDO，NMNH:NMN+比例为0.10 ± 0.03，而NADH:NAD+比例为100 ± 30。随后，他们找到了梭菌来源利用NADP+的丁二醇脱氢酶（Cs (R)-Bdh）进行NADPH/NMNH体系的测试。当反应中包含Tp Nox、Cs (R)-Bdh、GDH Ortho 及 Ser (S)-Bdh Ortho时，5g/L m-BDO被转化为3.9g/L的(SS)-BDO。当反应中包含Nox Ortho、 Kp m-Bdh Ortho、GDH WT 及Cs (R)-Bdh时，2g/L m-BDO 被转化为1.9g/L (RR)-BDO。

在体外证明设想后，他们在体内也做了验证。首先他们以NADH/NMNH作为氧化还原体系，将Lb Nox、Bs (R)-Bdh、GDH Ortho、Ser (S)-Bdh Ortho以及Zymomonas mobilis (Zm Glf ) 在MX102 R0中过表达，将全细胞与葡萄糖、NMN+以及5 g/L m-BDO 反应后, 可以得到3.8 g/L (SS)-BDO。随后也验证了NADPH/NMNH氧化还原体系的可行性，当TpNOX、Cs (R)-Bdh被引入宿主中时，可生成2.5 g/L (SS)-BDO。实验证明两种体系均需要NMN+作为正交辅因子，当体系中没有NMN+时，产物比较杂，当体系中含有10mM NMN+时，可合成高纯度的(SS)-BDO。

最后，他们将Nox Ortho、m-Bdh Ortho与含有NADP+结合的Rossmann类似结构域的超家族的617个蛋白进行比对，发现这些突变位点高度保守。Nox Ortho中的I59T位于Rossmann折叠的高度保守的α1螺旋，与NMNH形成极性作用，可以增强NMNH的活性。m-BDO Ortho中的M189T位于Rossmann折叠另一个α 螺旋上，突变其他BDH上的等位氨基酸，也可以提高NMNH的活性。Nox Ortho及m-BDO Ortho中阻断NAD(P)+结合的位点也高度保守，这些结果表明该设计原则可应用于含有Rossmann类似结构的蛋白，使其可以利用非天然辅因子。

综上所述，该研究通过酶改造建立了基于NMNH的正交系统，通过调控氧化还原状态在体内和体外均实现了丁二醇手性的控制，借助计算机模拟分析，他们建立了通用的设计原则，可用于改造更多的酶利用廉价非天然辅因子。

李晗博士，加州大学尔湾分校副教授，课题组主要从事合成生物学、代谢工程、及蛋白质工程方面研究。李晗博士于2008年获得清华大学学士学位，2008年至2013年在美国加州大学洛杉矶分校师从James Liao获得博士学位，随后于2013-2015在The Scripps Research Institute师从Peter Schultz进行博士后研究。自加州大学尔湾分校成立独立研究小组以来，李晗博士获得了美国国家自然基金会NSF CAREER Award早期职业生涯奖、美国国立卫生研究院NIH Director's New Innovator Award院长创新奖、以及斯隆研究奖Sloan Research Fellowship等多项奖项。在Science、Nature Communications、ACS Catalysis、Nature Chemical Biology及ACS Synthetic Biology等知名期刊发表多项论文(实验室网址https://sites.google.com/a/uci.edu/li-laboratory/home?authuser=0)。

课题组工作学习氛围活跃，长期招聘博士后及交流学者，欢迎对合成生物学感兴趣的学生及博士后来交流及加入一起成长进步，有意者请投递简历。

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