药学1区: 山东中医大附院揭示苦参碱通过MAPK通路抑制M2巨噬细胞极化减少小鼠创伤性异位骨化

【写在前面】：巨噬细胞作为免疫调节的关键角色，一直是国家自然科学基金研究的热点领域。在中医药学界，这一主题同样备受瞩目。

本期推荐的是由山东中医药大学附属医院等研究团队近期发表于Biomedicine & Pharmacotherapy(IF=6.9）的一篇文章，揭示苦参碱通过MAPK通路抑制M2巨噬细胞极化减少小鼠的创伤性异位骨化的研究论文。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Matrine reduces traumatic heterotopic ossification in mice by inhibiting M2 macrophage polarization through the MAPK pathway

本研究探讨了苦参碱在调节巨噬细胞极化及影响小鼠创伤性异位骨化（HO）中的潜在作用。HO是一种在非骨骼组织中异常骨形成的病理状态，常见于严重创伤或手术后，其发展与炎症反应和巨噬细胞活性密切相关。

研究发现，苦参碱能有效抑制骨髓源性巨噬细胞（BMDM）向与HO进展相关的M2型抗炎表型的极化。体外实验表明，苦参碱能够抑制M2型巨噬细胞的关键标志物，并阻断BMDM中的MAPK信号通路。体内实验进一步证实，苦参碱处理显著减少了小鼠跟腱中的HO形成，并降低了与M2巨噬细胞及MAPK信号通路相关的生物标志物表达。

综上所述，苦参碱通过调节巨噬细胞极化和抑制MAPK信号通路，显示出治疗创伤性异位骨化的潜力，为临床治疗提供了新的策略方向。

图文摘要

【前言】

创伤性异位骨化（HO）是一种病理过程，其特征是非骨骼组织中的异常骨形成。这种情况通常在严重创伤或手术后发生，如在骨折修复、截肢手术或关节置换手术后。不仅会引起疼痛和肿胀，还会严重影响患者的日常生活和生活质量。尽管创伤性HO的确切机制尚未完全阐明，但已知它与增强的炎症反应和异常骨形成有关。

巨噬细胞是免疫系统中的一种关键细胞类型，在免疫反应、炎症和组织修复中发挥着至关重要的作用。活化的巨噬细胞在HO发展过程中表达骨诱导信号因子，包括IL-6、IL-10、TGF-β和神经营养因子-3。它们的激活和招募推动了HO的进展。HO的形成过程涉及间充质干细胞（MSCs）的软骨生成和成骨分化、血管生成增强以及缺氧微环境的发展。巨噬细胞免疫反应的显著失调也在HO动物模型中得到了证实。

张捷等人已经证明，巨噬细胞分泌的神经营养因子-3可以促进大鼠的HO。在Acvr1cR206H/+小鼠中，巨噬细胞和肥大细胞的耗竭显著减弱了损伤诱导的HO，使损伤诱导的HO体积减少了约50%，证实了免疫系统参与了HO的发生和发展。 在中枢神经系统损伤患者中，研究表明，巨噬细胞衍生的抑癌素M通过促进基质细胞的成骨分化和矿化来促进神经源性HO的形成。因此，巨噬细胞可能是治疗HO的合适靶点。

M2型巨噬细胞是一种通常与抗炎和修复过程相关的亚型。在许多研究中，M2巨噬细胞极化被认为是推动HO发展的重要因素之一。M2型巨噬细胞能分泌多种生长因子和细胞因子，如TGF-β，这些因子促进骨细胞的活化和骨组织的形成， 为HO的发展创造了有利的微环境。

近年来，随着对中医药的深入理解和广泛研究，越来越多的中草药单体成分显示出显著的药理活性和潜在的治疗价值。苦参碱是一种用于治疗炎症和关节疼痛的药物，源自传统中草药苦参，具有抗炎、抗肿瘤和抗病毒等多种药理作用。实验数据表明，苦参碱可以影响巨噬细胞向M2表型的极化，其作用机制可能与其抗炎活性有关，可能通过干预特定信号通路来抑制巨噬细胞的M2极化。

本研究探讨了苦参碱对M2型巨噬细胞极化抑制HO能力的影响，旨在更深入地了解HO的致病机制，并确定潜在的治疗靶点。这项研究不仅为HO的治疗提供了新的策略，而且为相关领域的医学研究提供了宝贵的见解。

【结果部分】

1. 巨噬细胞参与小鼠HO的形成

在小鼠接受跟腱切断术联合背部烧伤手术后两周后，收集了它们的跟腱组织，并进行了免疫荧光（IF）检测，以识别巨噬细胞标记物F4/80的表达。结果证实，对照组F4/80表达极低，而异位骨化（HO）组F4/80表达显著增加。与HO组相比，Cloda组（小鼠在建立HO模型后注射氯膦酸脂质体）F4/80表达显著降低，证实小鼠体内的巨噬细胞成功耗竭（图1A）。在建模过程后的八周，收集小鼠的跟腱组织进行了苏木精-伊红（HE）染色和微型计算机断层扫描（micro-CT）检查。HE染色显示对照组的腱组织排列良好。相比之下，HO组的腱内有大量成熟的骨组织，而Cloda组只有少量骨组织形成（图1B）。最后，通过micro-CT扫描观察了每组的HO形成情况（图1C）。进一步对每组HO体积的定量计算显示，Cloda组的体积显著小于HO组（p < 0.001）（图1D）。上述结果证实，巨噬细胞可以影响小鼠异位骨化的形成。

2.苦参碱抑制 BMDM 向 M2 巨噬细胞的极化

通过RT-PCR测定，我们确认在用20 ng/mL IL-4处理后，BMDMs中M2巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β1、CD206和ARG-1的表达水平显著高于对照组（图2A和D）。然而，在与10μM或20μM苦参碱共处理后，这些基因的表达水平显着降低（p < 0.01）。接下来，使用流式细胞术测量CD206的表达。我们观察到，IL-4刺激BMDMs后，与对照组相比，CD206的表达显着升高（p < 0.001）。然而，用 20 ng/mL 苦参碱处理后，这些基因的表达显着降低 （p < 0.001） （图2E 和 F）。此外，通过IF实验检测CD206的表达。我们发现，用IL-4处理后，BMDMs中CD206的荧光强度比对照组增加。然而，用 20 ng/mL苦参碱处理后，荧光强度显着降低 （图2），这些结果表明，苦参碱可以抑制BMDMs向M2表型的极化。

3.苦参碱抑制 BMDM 中的 MAPK 信号通路

使用蛋白质印迹法证实了苦参碱对 MAPK 信号通路的影响。首先，用苦参碱（20μM）处理BMDMs 3小时，然后用IL-4刺激。采用WB分析p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38和P38的蛋白表达。苦参碱以时间依赖性方式抑制 p-ERK 和 p-P38 磷酸化，但对 p-JNK 无影响 （图3使用ImageJ量化p-ERK、p-JNK和p-P38的相对水平，并分别归一化为总ERK、JNK和P38（图3BD）。这些结果表明，苦参碱可以抑制BMDMs中的MAPK通路。

4.苦参碱对MC3T3-E1细胞的成骨分化或矿化没有直接影响

在MC3T3-E1细胞成骨诱导后，细胞被用不同浓度的苦参碱处理（图S1-C）。7天后细胞进行碱性磷酸酶（ALP）活性染色，21天后用AR进行矿化染色（图4A）。通过定量分析，我们发现苦参碱并不直接影响MC3T3-E1细胞的成骨分化或矿化（图4B和C）。

5.苦参碱抑制小鼠跟腱中的异位骨形成

在建模后8周，收小鼠的跟腱组织。首先，微型计算机断层扫描（micro-CT）显示HO组小鼠的跟腱中有显著的异位骨化（HO）形成。然而，在用不同浓度的苦参碱处理的小鼠中，HO明显减少（见图5A）。HO体积的差异显著（p < 0.001）（见图5B）。随后，进行了免疫组化（IHC）检测CD206和p-ERK的表达（见图5C）。在HO组中，CD206和p-ERK的表达显著升高，而在用不同浓度的苦参碱处理的小鼠中，CD206和p-ERK的表达显著降低（p<0.01）（见图5D和E）。最后，通过免疫荧光（IF）实验检测了每组中骨桥蛋白（OCN）的表达（见图5F）。结果显示HO组中OCN表达显著升高，而在用不同浓度的苦参碱处理的小鼠中OCN表达显著降低（p < 0.001）（见图5G）。综上所述，苦参碱抑制了小鼠体内的HO，并在体内抑制了CD206和p-ERK的表达。

【结论与讨论】

在本文研究中，我们开发了一个结合背烧损伤和跟腱横断的异位骨化(HO)模型，这一模型已被广泛采纳。通过巨噬细胞耗竭实验，我们证实了巨噬细胞在HO发展中的关键作用，它们不仅参与间充质干细胞(MSCs)的成骨和软骨分化，还创造缺氧微环境，促进血管生成。研究显示，巨噬细胞和肥大细胞的联合耗竭能有效阻断HO，且单独耗竭巨噬细胞也能阻止HO形成。此外，Li等人报道，BMSC衍生的外泌体通过调节M1/M2型巨噬细胞极化促进肌腱骨愈合。我们的研究还发现，在炎症早期，M2型巨噬细胞在HO的发生中起着至关重要的作用。

巨噬细胞能够根据环境信号分化为促炎的M1型或抗炎的M2型。我们的实验结果一致表明，苦参碱显著抑制了骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)向M2表型的极化，降低了关键M2型标志物的表达，这可能引导巨噬细胞活动至不利于纤维化和骨化的状态。M2型巨噬细胞分泌的成骨因子与HO形成密切相关。苦参碱作为一种具有抗炎、抗氧化、神经保护和抗肿瘤特性的天然生物碱，可能通过防止BMDM向M2表型的极化来抵消这种转变。

HO的机制涉及多种细胞类型和信号通路，其中最关键的是启动骨形成的祖细胞。我们的研究表明，苦参碱并不直接影响MC3T3-E1细胞系的成骨分化，而是可能通过抑制巨噬细胞的M2极化间接抑制祖细胞的成骨分化。

MAPK信号通路在细胞增殖、分化和炎症等多种细胞过程中发挥核心作用。我们的研究发现，苦参碱选择性地抑制了MAPK通路中ERK和P38的磷酸化，而不影响JNK，这表明苦参碱对BMDM的影响至少部分通过调节MAPK通路进行。

体内实验进一步证实了苦参碱减少小鼠跟腱异位骨形成和降低与M2型巨噬细胞及MAPK通路相关的标记物表达的效果。然而，我们的研究只关注了苦参碱抑制M2型巨噬细胞极化的能力，而未考虑其对M1型巨噬细胞的影响，这是研究的一个局限。

综上所述，我们的研究揭示了巨噬细胞与创伤性HO之间的复杂相互作用，并表明苦参碱通过调节巨噬细胞极化和抑制MAPK通路关键成分，具有成为治疗HO潜在主导药物的潜力。未来的研究应侧重于阐明其精确的分子机制，评估最佳给药方案，并评估苦参碱的长期安全性和临床疗效。

注：本文原创表明为原创编译，非声张版权，侵删！

中医药基础科研服务：

相关咨询，加微信：1278317307。

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。