脑声常谈丨啮齿动物甲状腺功能减退模型及方法评估

甲状腺功能减退（简称甲减）是一种甲状腺激素缺乏的病理状态，除了会引起黏液性水肿、记忆力减退和心动过缓等一系列甲状腺激素减少所带来的症状外，甲状腺激素的减少和促甲状腺激素的增加也是全身多个系统疾病的独立危险因素。通过小鼠建立甲减模型的主流方式是药物造模，但药物造模无法避免药物对于甲状腺外组织产生的一系列作用从而影响实验结果。

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在动物模型中，诱导甲状腺功能减退的方法较多。通过敲除特异性甲状腺受体或去碘酶等基因，可造成稳定的甲状腺功能减退动物模型，但是基因敲除造模程序复杂，需要耗费大量人力和时间，通常获取一个基因剔除的纯合子小鼠需要大约1年时间，且基因敲除纯合小鼠很难通过自身繁殖获得纯合敲除的后代，所以，很难将基因敲除所造甲状腺功能减退模型小鼠进行大面积推广，但基因敲除造成甲状腺功能减退模型对于研究中枢性甲状腺功能减退或去碘酶缺乏等特殊类型的甲状腺功能减退具有不可替代的优势。

抗甲状腺药物、放射性碘或低碘饮食均可造成实验动物甲状腺功能减退。抗甲状腺药物主要包括用丙硫氧嘧啶或甲巯咪唑喂养实验动物，造成动物血清T3、T4下降，TSH升高，该方法的优点是造模方法简单，成功率高，但该方法造模所需时间较长，且一旦停止喂药，甲状腺激素水平极为不稳定，甲状腺功能减退状态很快会消失，更为重要的是，无法排除抗甲状腺药物对于动物机体其他器官及组织所产生的干扰性影响。放射性碘注入实验动物体内后，被甲状腺所凝聚，造成甲状腺细胞坏死，从而引起甲状腺功能的减退，但该方法对于造模设备要求较高，且存在放射性物质污染风险，在一般实验中应用较少。

低碘饮食造模，主要通过喂食实验动物低碘饮食实现，造模方法简单，但可控性较差，且用时较长，主要被用于研究碘缺乏相关疾病。

手术切除甲状腺可以快速造成实验动物甲状腺功能减退，且甲状腺功能减退状态较为稳定，该方法在许多实验中被应用，其中Wistar大鼠或SD大鼠被应用最多，甲状腺全切模型的建立不仅要求尽可能完整的将甲状腺切除，而且要求在手术同时，要尽可能的保护甲状腺周围的重要器官、组织，如气管、喉返神经、甲状旁腺及食管等，损伤这些重要器官或组织，将大大增加实验动物的致死率，甲状腺全切的小鼠模型报道较少也可能与其手术高死亡率有关。

动物模型的分组及建立

将C57BL/6和KM雄性小鼠各分为假手术组（5只）、术式I组（10只）和术式II组（10只），手术前所有小鼠均饮用纯净水和普通大鼠维持饲料，术后假手术组继续术前饮食，术式I和术式II组大鼠以0.1%葡萄糖酸钙水和普通小鼠维持饲料喂养。由于C57BL/6小鼠和KM小鼠体型及甲状腺解剖结构相似，故其手术方法一致。甲状腺的暴露：利用麻醉剂腹腔注射麻醉小鼠并固定，在小鼠对应颈后垫一块5cm×1cm×0.5cm纱布垫使术野更为暴露，自小鼠胸骨上窝的颈正中为起点，向上切开皮肤约1cm，切开后可见左右两下颌腺由被膜相连，用眼科显微直剪钝性分离，分离后可见完整颈前肌，用眼科显微弯镊自切口视野正中轻轻提起颈前肌，眼科显微弯剪垂直于颈前肌正中刚好刺入肌组织，然后钝性分离约1cm。此时气管和甲状腺暴露于术野。将覆盖于甲状腺外侧的带状肌钝性分离，直至甲状腺与其完全分离，并用小拉钩将带状肌及其外侧组织拉开，充分暴露甲状腺。假手术组至此步骤后缝合。

术式I：将甲状腺侧叶提起并轻轻翻转，暴露该侧甲状腺背侧于视野，从上级入针点结扎甲状腺上级动脉并沿线头近甲状腺侧将血管离断，注意应尽量靠近上极血管，并完全避免结扎到除血管、被膜之外的任何组织。用同样手法结扎另一侧甲状腺上动脉，紧贴结扎处，在线头靠甲状腺侧锐性离断上极血管，从一侧甲状腺上级开始沿被膜将甲状腺撕离气管，注意整个过程应保证甲状腺后被膜的完整性，并避免接触喉返神经，直至剥离至离断另一侧上极血管。将摘除甲状腺放于4%多聚甲醛中固定。

术式II：首先提起一侧腺体，暴露上极血管，锐性离断上极血管，快速提起另一侧上极血管，并锐性离断血管，小棉签双侧轻轻按压止血30~120s，出血减少后，用与术式I同样手法剥离甲状腺组织。最后确认气管无甲状腺组织附着、无活动性出血后（如有出血可轻按压止血），轻取纱布垫，复位气管和带状肌，逐层缝合肌肉、下颌腺和皮肤，碘伏消毒皮肤，纱布覆盖。分别记录各组每只小鼠手术用时。

记录指标：

体重：于小鼠入组开始，每日记录小鼠死亡情况；于术前第7天、术后第7、14、21、28天分别记录各组小鼠体重情况。

血清甲状腺相关激素分析：术前第7天和术后第28天，通过眼眶取血。1.5mLEP管收集血液，利用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中TT3、TT4及TSH含量。

行为学表现：

甲减小鼠出现活动迟缓，倦怠嗜卧，体型瘦削，捕捉时可以感觉到小鼠皮肉松懈，尾巴发凉，反抗力变小等表现。表现为少动嗜睡、脱毛等，可能是该阶段甲状腺激素浓度显著下降。

行为学测试方法

恐惧记忆保持测试（retention test）

单次电击训练24h后，将小鼠放回明箱，中间的拱门自动打开，记录小鼠进入暗箱的时间潜伏期，整个实验过程均不给电击。通过计算小鼠在训练时首次受到电击的潜伏期、24小时后再次进入暗室的动物数、潜伏期等指标。结合化学遗传学方法、药理学手段控制脑内胆碱能神经活性，评价胆碱能系统对甲减小鼠的认知功能影响。

新物体识别试验

新物体识别试验系统（Novel object recognition test）由测试笼（40×40×35cm）、高清摄像机、计算机及数据采集和分析系统组成。该系统是根据小鼠的探究行为，对新事物有明显的探索倾向，从而建立起来测定小鼠学习记忆能力的一种方法。该研究方法是让动物在自由活动状态下测试其学习记忆能力，外界干扰因素小，得出的结论更有说服力。此外，本研究手段还可以测试动物的短期或长期记忆形成机制等。新物体识别试验过程主要分三步：适应期、训练期和记忆测试期。行为学实验开始前6天，每天对小鼠进行温和的触摸适应（gentle handling），每天3次，每次2min，每次触摸之间的时间间隔应为15min以上。随后可进行新物体识别试验，其具体步骤为：

1.第一天，将小鼠依次放入实验记录笼中，适应阶段该记录笼内无任何物体，使小鼠自由探索5min对实验环境进行适应，从而可减少实验时小鼠的应激性。每一批小鼠适应结束后，以10%的乙醇清洁记录笼，自然风干后，再开始下一批小鼠的适应。2.第二天，在实验记录笼内底板的两侧对应的位置放置两个大小、形状、颜色完全相同的物体（比如两个同样的乐高积木A1和A2），将小鼠轻轻放入实验记录笼的中心位置，让小鼠在实验记录笼内自由探索10min后，取出小鼠并放回原小鼠的饲养笼。每次实验结束，均以10%的乙醇清洁记录笼，自然风干后开始下一批小鼠的训练。3.第三天，训练完成24h后，开始进行小鼠的记忆能力测试。将实验记录笼的其中一个物体保持不变（A1），另一个物体换为一个完全不同大小、形状或颜色的新物体（A3）。A1为第二天训练时的熟悉物体，而A3想对于原来的物体（A2）则是一个新奇物体。将小鼠重新放入实验记录笼的中心位置，让小鼠自由探索5min，并记录小鼠探索熟悉物体（A1）和新奇物体（A3）的时间。小鼠对新奇物体的偏爱可以用偏爱系数进行量化，其计算方法为：N/（N+F）×100%，其中：N表示小鼠对新奇物体（A3）的探索时间，F表示小鼠对熟悉物体（A1）的探索时间。以偏爱系数评价小鼠的记忆能力。

Morris水迷宫实验

海马是参和认知活动的重要中枢部位。甲状腺激素对海马有直接或间接的生理作用，解释了甲减所致的神经行为学机能障碍。进行Morris水迷宫实验，装置：水迷宫反应桶，直径120cm，高度50cm，充自来水于25cm处，水温23~24oC，逃逸平台为直径6.5cm，高度15cm（最高平面在水下1cm），平台随机置于其中一个象限。4个几何图形作为线索，线索的形状不同（三角形、菱形、正方形、圆形），颜色涂成黑色，宽15cm。且迷宫外线索固定。

图片来源于公众号：脑声常谈

Morris水迷宫主要分为2个部分，定位航行实验、空间搜索实验。定位航行实验：用于观察小鼠学习和记忆的能力。操作：将小鼠头向上朝向池壁，选取起始象限，分别从4个象限各选一个入水点。小鼠放入水中，实验开始。计算机定位小鼠，并进行跟踪、记录、计时，以入水至爬上平台所用时长记为逃避潜伏期。限制时间为60秒。小鼠登上平台后使其停留30秒再移开。若不能爬上平台，则由实验者引导待30秒后再移去。一次实验完成之后，下次实验开始前预留实验间歇。间歇期，所有小鼠用干毛巾擦拭，并置于暖风旁，注意保暖。每天接受4次训练，连续进行5天。空间搜索实验：检验小鼠记忆的读取及保持能力。在训练后最后一天（第6天）将平台撤下，并由计算机圈定原平台位置，四个象限随机选取一点将小鼠头向上面向池壁轻柔地置于水中，计算机记录其60秒内的游行路径，随后统计小鼠60秒内所穿越原平台所在位置的次数，共评估4次，取均值。

抗疲劳作用实验

对甲减小鼠进行抗疲劳作用实验。装置一：转棒式疲劳仪。实验前24h做适应性训练，设定为20min，记录小鼠跑步时间，若20min仍未落棒记为20min。实验结束前一周截止，一周一次，连续测3周。用于F1和F2的抗疲劳作用评估。装置二：YLS-10B转轮式疲劳仪。通道设置为8，即8个通道同时运转。电击耐受时间设定为2秒。运动难易程度设定为“中”。判定力竭为5分钟内3次。休息时间设定为30秒。转速设定为25r/min。刺激电流(限流)设定lmA。转轮转动，小鼠开始跑步。当小鼠电击也不在跑步时，电闸断电，最后一个小鼠停止时，电机停止。记下每只小鼠跑步的时间。每周一次，连续测3周。用于F3的抗疲劳作用评估。

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