中国白酒作为世界著名的六大蒸馏酒之一,酿造历史可追溯上千年,特有的口感和香味深受消费者喜爱。其中浓香型白酒因其独特的发酵酿造过程和“窖香浓郁、绵柔甘冽、香味协调”的酒体风格成为中国白酒的典型代表。窖泥是一种富含微生物、高含水量、高腐殖质和低含氧量的特殊性土壤,是浓香型白酒发酵酿造的重要场所,其质量优劣在很大程度上取决于其微生物群落组成及物种多样性。
不同地区白酒企业的窖泥真菌群落多样性差异较为明显,针对特定酿酒企业开展窖泥真菌研究尤为必要。金徽酒产于长江上游、西秦岭南麓的“西部酒乡”甘肃陇南徽县境内,其生态酿酒环境独特,于2012年入选为国家地理标志保护产品。历史传承形成的低温入窖、长周期低温发酵、缓火蒸馏、低温陈酿、低温过滤等酿造工艺造就了金徽酒“只有窖香、没有泥味”的独特品质。
兰州理工大学生命科学与工程学院的任海伟、李志娟、张丙云*等人为详细了解甘肃金徽酒股份有限公司不同窖龄窖池窖泥的真菌群落多样性与空间异质性,以该公司10 a和50 a窖龄窖泥为研究对象,采用Illumina NovaSeq高通量测序技术分析窖泥真菌群落多样性,基于冗余分析(RDA)探究影响窖泥真菌群落分布的理化因素,利用FUNGuild功能预测揭示不同窖龄窖池和空间位置窖泥真菌营养类型和功能类群,以期为窖泥驯化、窖泥功能菌筛选和酿酒品质提升奠定理论基础。
1不同窖龄窖池和空间位置窖泥的理化指标
研究表明,窖泥理化性质可以影响白酒酿造过程中微生物群落结构的形成,在一定程度上也可以反映窖泥质量,是评价窖泥质量的重要指标。刘梅等认为质量越好的窖泥,pH值更接近于7。如表1所示,10 a窖龄窖泥的pH值介于3.50~3.90之间,而50 a窖龄窖池的pH值明显升高,尤其窖壁上层和窖底泥层的pH值更接近7,说明50 a窖龄窖泥质量整体上优于10 a窖泥,这可能是因为10 a窖泥中的乳酸杆菌属(
Lactobacillus)明显高于50 a窖泥,而
Lactobacillus的富集可以导致其代谢物乳酸的积累,进而造成窖泥pH值的下降,因此窖泥的pH值可以作为初步判定窖泥质量优劣的依据。由表1还可看出,随着窖池深度的增加,10 a窖龄窖泥的水分、腐殖质、Ca 2+ 含量总体呈现升高的变化趋势,窖底泥明显高于窖壁泥(
P<0.05);而50 a窖龄窖泥的水分、腐殖质、Ca 2+ 含量呈现先升高后降低趋势,窖壁泥明显高于窖底泥(
P<0.05)。另一方面,随着窖池窖龄的增加,水分、腐殖质、Ca 2+ 、K + 含量明显降低,而pH值则显著升高(
P<0.05),这与张会敏等报道的老窖泥pH值高于新窖泥、新窖泥Ca 2+ 含量高于老窖泥结果一致,也说明了不同窖龄和空间位置的窖泥与空气接触频次、与黄水接触程度、持水性和微生物组成等因素密切相关。与此同时,腐殖质含量的高低也是判断窖泥质量优劣的重要指标之一,其含量高低直接影响浓香型白酒质量。总之,不同窖龄窖池和空间位置窖泥的理化性质存在一定差异,理化性质的差异也进一步反映了在白酒酿造过程中需要因时因势不断改善酿酒工艺或优化物质配比,从而保障窖泥微生物菌群处于高效稳定动态平衡状态。
2 高通量测序数据合理性分析
通过Illumina NovaSeq平台对窖泥真菌群落进行测序分析,测序数据经过barcode拆分后获得1 286 316 条平均长度为181~237 bp的有效真菌序列。获得所有样品的全部原始序列后,对其进行质量控制、去噪、拼接,并且去嵌合体,形成OTU。按照97%的默认值对优化真菌序列进行分组,共获得8 415 个OTU,各窖泥样本的OTU数量分布介于255~505。每个样本的覆盖率均大于99%,说明测序数目足够,测序序列可以代表窖泥真菌群落组成。
3 金徽酒窖泥真菌群落的
多样性分析Shannon指数表示物种的多样性,Chao1指数表示物种的丰富度,其中Chao1指数对稀有物种更敏感。如图2所示,从空间位置看,10 a窖池窖泥的多样性和丰富度随窖池深度的增加呈现降低趋势,窖壁上层的多样性和丰富度显著高于其他位置(
P<0.05),这可能是因为窖壁上层窖泥与空气接触程度较大,氧气含量越高,有利于好氧型真菌生存。50 a窖池窖泥的多样性随着窖池深度的增加整体呈现升高趋势,丰富度则呈现先降低后升高的趋势,窖底层多样性和丰富度均显著高于其他位置(
P<0.05),因为50 a窖池窖底泥的理化环境有利于真菌菌群生存。另一方面,10 a窖池窖壁层的真菌多样性和丰富度显著高于50 a窖泥(
P<0.05),而50 a窖底泥的真菌多样性和丰富度均显著高于10 a窖泥(
P<0.05),这是因为随着窖池窖龄的增加会产生黄水下沉,窖壁泥暴露在空气中使其水分流失,真菌生存条件变差,进而导致真菌多样性和丰富度下降。另一方面,窖底泥长期处于黄水环境,黄水中真菌进入窖底泥并富集,促使其多样性和丰富度提高。
4 金徽酒窖泥真菌群落的
多样性分析为进一步分析窖泥真菌群落的相似性,对真菌群落进行PCoA和非加权组平均法(UPGMA)层级聚类分析。由图3a可知,PCoA横纵坐标之和为24.34%,说明真菌群落结构复杂,2 个PCo难以在很大程度上对其进行解释。从空间位置看,50 a窖泥MWPM50和DWPM50样品距离较近,UWPM50和BPM50样品距离较近,表明50 a窖池窖壁中层和下层窖泥的真菌群落组成相似,50 a窖壁上层和窖底泥的真菌组成相似,而10 a窖池不同位置窖泥样品距离较远,未出现聚类,表明10 a窖龄窖池不同位置窖泥的真菌群落组成有明显差异。从窖龄角度看,不同窖龄同一位置窖泥样品距离较远,说明其群落组成差异显著。由图3b 可知,所有窖泥样品共分为3 簇,其中样品UWPM50和BPM50分别单独聚为一簇,其他窖泥样品聚为另一簇,表明在长期发酵过程中,窖池窖泥真菌群落存在明显的空间异质性,其中样品UWPM50和BPM50的真菌群落变化程度快于其他位置窖泥。PCoA和UPGMA聚类的结果基本一致,说明窖龄和空间位置对真菌群落组成的相似性和差异性有一定影响。
5 基于门水平的窖泥真菌群落结构分析
基于OTU注释共得到21 个真菌门,平均相对丰度超过0.1%的有8 个,其中Ascomycota(62.12%)、Basidiomycota(17.18%)、Mortierellomycota(1.32%)和Rozellomycota(1.01%)是金徽窖泥的优势真菌门(平均相对丰度≥1%),此外还含有较低丰度的球囊菌门(Glomeromycota,0.13%)。另外,Ascomycota和Basidiomycota在10 a和50 a窖池不同位置窖泥中均占绝对优势,是窖泥的绝对优势真菌门。
如图4 所示,从空间位置看,10 a 和50 a 窖泥Ascomycota相对丰度随着窖池深度的增加均呈现先升高后降低趋势,窖壁下层Ascomycota相对丰度极显著高于其他位置(
P<0.01)。类似地,10 a窖泥Basidiomycota和Mortierellomycota相对丰度随着窖池深度的增加呈现先降低后升高趋势,Rozellomycota相对丰度则呈现显著降低趋势,其中窖壁上层Mortierellomycota和Rozellomycota相对丰度显著高于其他位置。50 a窖池窖泥Basidiomycota和Mortierellomycota相对丰度随窖池深度增加整体呈现升高趋势,其中窖壁中层Basidiomycota和Rozellomycota相对丰度显著高于其他位置,窖底层Mortierellomycota相对丰度也显著高于其他位置。有研究表明,Ascomycota不仅是浓香型白酒窖泥中的优势真菌门,同时也是酱香型白酒生产中的主要真菌菌群。
从窖池窖龄看,窖壁上层和中层Ascomycota相对丰度随着窖龄的增加而呈现升高趋势,且50 a显著高于10 a,而窖壁下层和窖底泥Ascomycota相对丰度则呈现显著降低趋势,且10 a显著高于50 a。另一方面,窖壁上层、窖壁中层和窖底泥Basidiomycota相对丰度随着窖龄的增加呈现显著降低趋势,窖壁下层Basidiomycota相对丰度则呈现显著升高趋势。再者,窖壁上层Mortierellomycota相对丰度随着窖龄的增加呈现显著降低趋势,窖底泥Mortierellomycota相对丰度则呈现显著升高趋势(
P<0.01),但其他位置Mortierellomycota相对丰度差异不显著(
P>0.05)。窖壁中层和窖底层Rozellomycota相对丰度随着窖龄的增加均呈现显著升高趋势(
P<0.01)。
总体而言,不同窖龄和空间位置窖泥的优势真菌门相对丰度差异显著,表明不同窖池窖龄和空间位置窖泥的理化环境在一定程度上均能够影响优势真菌门的结构分布和演替规律。
6 基于属水平的窖泥真菌群落结构分析
金徽酒窖泥在属水平上共鉴定出520 个真菌属,其中14 个属为优势真菌属(所有样品的平均相对丰度≥1%),其余未知真菌属和非优势真菌属归为others。14 个优势真菌属分别为枝孢菌属(
Cladosporium
Aspergillus、红曲霉属(
Monascus)、嗜热真菌属(
Thermomyces)、假散囊菌属(
Pseudeurotium)、德克酵母属(
Dekkera)、毕赤酵母属(
Pichia)、哈萨克斯坦酵母属(
Kazachstania)、枝顶孢霉属(
Acremonium)、镰刀霉属(
Fusarium)、被孢霉属(
Mortierella)、维希尼克氏酵母属(
Vishniacozyma
Archaeorhizomyces
Neocosmospora,占总丰度的79.24%。窖泥中的绝对优势真菌属(每个样品的相对丰度≥1%)包括
Aspergillus
Monascus
Kazachstania
Fusarium,但不同窖龄窖泥的绝对优势真菌属有所差异。10 a窖池窖泥中的绝对优势真菌属分别为
Cladosporium
Monascus
Fusarium
Aspergillus
Kazachstania,50 a窖池窖泥中的绝对优势真菌属为
Aspergillus
Kazachstania
从图5 空间位置角度分析可知,10 a 窖池窖泥
Aspergillus相对丰度随窖池深度的增加呈现先降低后升高趋势,且窖底层显著高于其他位置,而
Kazachstania相对丰度变化趋势与之相反,且窖壁下层显著高于其他位置。50 a窖池窖泥
Aspergillus
Kazachstania相对丰度随着窖池深度的增加呈现先升高后降低趋势,且二者在窖壁下层相对丰度均显著高于其他位置。就窖泥窖龄而言,除窖壁下层外,其他位置
Aspergillus相对丰度均随窖池窖龄的增加呈现显著降低趋势。窖壁上层
Kazachstania相对丰度则随着窖龄的增加呈现升高趋势,而其他位置
Kazachstania相对丰度则呈现显著降低趋势(
P<0.01)。原因可能是在白酒酿造过程中开窖和封窖等操作会使其营养成分和含氧量不断改变,进而使微生物群落结构发生演替。据报道
Aspergillus能够产生淀粉酶和蛋白酶等,是白酒酿造过程中淀粉等大分子物质分解的主要动力之一。
Kazachstania等酵母类真菌在大曲样品中的相对丰度较高,在白酒发酵过程中对乙醇、有机酸和多类酯等物质的产生具有重要作用。
另外,10 a窖龄窖池不同位置
Acremonium、不同窖龄窖壁上层
Fusarium
Neocosmospora、不同窖底层
Pichia
Mortierella,以及窖壁底层
Cladosporium相对丰度差异均不显著(
P>0.05),但
Aspergillus
Kazachstania等大多数优势真菌属的相对丰度差异显著,说明窖池窖龄和空间位置会影响窖泥真菌群落的分布。另外,未分类真菌属相对丰度范围为40.06%~87.41%,表明窖泥真菌群落结构复杂,包含多种在现有数据库中无法识别或未被识别的物种。孟雅静等研究发现安徽某酒企的新老窖泥真菌组成差异并不明显,但甘肃金徽酒不同窖龄和不同位置窖泥的绝对优势真菌属均存在明显差异。
进一步比较不同地区浓香型白酒窖泥真菌群落组成(表2),发现不同地区白酒窖泥的优势真菌门和优势真菌属组成确有差异,这可能与酿酒企业所在地理区域、水文土壤、气候条件以及窖池理化性质有关。
7不同窖龄窖池和空间位置窖泥的差异真菌分析
为进一步分析窖泥真菌菌群的差异性,利用LEfSe分析窖泥样品之间的差异真菌。LDA柱状图显示窖泥中有显著差异的真菌,柱的长度代表差异真菌影响值大小,其阈值分数为3.00。由图6可知,在属水平上,所有窖泥样品共检测出25 种差异真菌,其中,10 a窖泥含有6 种差异真菌,窖壁上层差异真菌为黏头霉属(
Myxocephala)、假散囊菌属(
Pseudeurotium)和
Bifiguratus,窖壁中层无差异真菌,窖壁下层差异真菌为
Cephalotheca
Parasarocladium,窖底层差异真菌为枝瑚菌属(
Ramaria)。50 a窖泥中共含有19 种差异真菌,窖壁上层差异真菌为假散囊菌属(
Pseudeurotium),窖壁中层差异真菌为节菱孢属(
Arthrinium)、丝膜菌属(
Cortinarius)和球腔菌属(
Phaeosphaeria),窖壁下层差异真菌为扇盘衣属(
Thysanothecium),窖底层差异真菌为拟青霉属(
Simplicillium)、栓菌属(
Trametes)、链孢霉属(
Neurospora)、珊瑚菌属(
Clavaria)、柄孢壳属(
Zopfiella)、梭链孢属(
Fusidium)、褐球菌属(
Phaeococcomyces)、裂褶菌属(
Schizophyllum
Saccharomycopsis、木拉克酵母属(
Mrakia
Sagenomella
Ophiosphaerella
Genolevuria,说明不同窖龄窖池和空间位置窖泥的差异物种数目和种类不同。另外,在25 个差异真菌中有3 个差异真菌的LDA值≥4,如科水平的假散囊菌科(Pseudeurotiaceae)、肉座菌科(Hypocreales)以及属水平的假散囊菌属(
Pseudeurotium),说明它们是对不同窖龄窖池和空间位置窖泥差异贡献最大的真菌群落。通过对窖泥差异真菌的分析,发现差异真菌均是样品中相对丰度较低的一类物种,但也是白酒酿造过程中发挥重要作用的微生物类群。
8 金徽酒窖泥理化指标与真菌菌群之间的RDA
研究表明,窖池窖泥理化指标的差异可能是影响窖泥微生物生长代谢或功能的因素,也是影响微生物群落
多样性的重要因素。利用RDA探究窖泥理化指标与绝对优势真菌属之间的相关性(图7),箭头长度代表相关性,中心点和窖泥真菌之间的连线与箭头的夹角,锐角表示真菌属与相应的理化因子呈正相关,钝角表示呈负相关。金徽窖泥的绝对优势真菌属与窖泥理化指标之间的关系如图7所示,其2 个主成分的总解释度为54.88%,按照RDA1和RDA2的划分,水分含量、腐殖质、Ca2+、K+集中在同一区域,pH值单独占据一个区域,在同一区域的理化因子变化趋势基本一致,而pH值则与其他理化因子变化趋势不同,这与表1分析结果一致。由图7还可看出,10 a窖龄的窖泥样品与水分、腐殖质、K+和Ca2+含量呈正相关关系,且10 a窖池窖泥中存在较多的Ca2+,然而50 a窖泥样品与pH值呈正相关。
Fusarium
Kazachstania
Aspergillus
Monascus与水分、腐殖质、K + 和Ca 2+ 含量呈正相关,与pH值呈负相关,而
Cladosporium
Vishniacozyma与pH值呈正相关,与水分、腐殖质、K + 和Ca 2+ 含量呈负相关。研究表明,
Aspergillus
Monascus等真菌可以产生液化酶(最适pH 6.0)和纤维素酶(最适pH 7.5)等多种功能酶系,低pH值会抑制这些微生物的生长,从而影响白酒风味物质的形成和白酒品质。由此可见,这些理化指标对窖泥真菌群落的分布影响较大,窖泥真菌群落的结构组成与理化指标密切相关。
9 金徽酒窖泥的物种相互作用网络分析
枢纽指与一定数量的其他微生物相关联,是整个环境中影响微生物相关网络的重要因素。对金徽窖泥的真菌群落进行网络分析以探索相对丰度位于前30的真菌菌属之间的相互作用关系。图8中有30 个节点、38 条边,所有节点分别隶属于Ascomycota(19 节)、Basidiomycota(9 节)、毛霉菌门(Mucoromycota)(1 节)和Mortierellomycota(1 节)4 个真菌门。窖泥中真菌群落同现网络的中心(边数≥5 的真菌属)为曲霉属(
Aspergillus)、红菇属(
Russula)、蜡壳耳属(
Sebina)、被孢霉属(
Mortierella
Archaeorhizomyces
Aspergillus
Monascus
Monilinia
Rhizomucor
Wickerhamomyces呈正相关,与
Archaeorhizomyces
Sebina
Russula呈负相关;
Russula
Archaeorhizomyces
Mortierella
Sebina
Inocybe呈正相关,与
Aspergillus呈负相关;
Sebina
Inocybe
Russula
Mortierella
Archaeorhizomyces呈正相关,与
Aspergillus呈负相关;
Mortierella
Sebina
Inocybe
Russula
Archaeorhizomyces呈正相关,与
Kazachstania呈负相关;
Archaeorhizomyces
Mortierella
Sebina
Inocybe
Russula呈正相关,与
Aspergillus呈负相关。从图8还可以看出,
Aspergillus
Kazachstania相对丰度显著高于其他真菌属,这与图6结果一致。同时,在同现网络中发现了
Scedosporium
Pseudeurotium
Dekkera
Peyronellaea4 个独立的模块,主要是由于能连接这4 个模块的节点或枢纽含量极少或消失,节点或枢纽种类和含量的减少导致微生物菌群网络碎片化。其中
Pseudeurotium是影响微生物菌群网络的重要真菌属之一,与图6中
Pseudeurotium是LDA值≥4的差异真菌,是对不同窖龄窖池和空间位置窖泥差异贡献最大的真菌群落研究结果一致。总之,通过同现网络分析,金徽酒窖泥的真菌群落之间形成相互影响的网络结构,核心真菌菌属之间直接或间接影响彼此生长和代谢,进而影响酿造环境中微生物体系平衡。
10金徽酒窖泥真菌FUNGuild功能预测
根据FUNGuild功能预测对不同窖龄窖池和空间位置窖泥真菌群落进行分类分析,从而了解和预测窖泥真菌群落功能。FUNGuild依据真菌的营养方式将真菌分为3大类:病理营养型、共生营养型和腐生营养型。基于这3大营养方式,进一步细分为若干个功能分组:动物病原菌、丛枝菌根真菌、外生菌根真菌、杜鹃花类菌根真菌、叶内生真菌、地衣寄生真菌、地衣共生真菌、菌寄生真菌、植物病原菌、未定义根内生真菌、未定义腐生真菌和木质腐生真菌等。
本实验FUNGuild功能预测置信水平选用highly probable、probable和possible,以保证预测的准确性。图9a结果显示,金徽酒窖泥的真菌主要预测得到病理营养型、病理-腐生营养型、病理-腐生-共生营养型、病理-共生营养型、腐生营养型、腐生-共生营养型、共生营养型共7 个不同的营养类型,其中腐生营养型和病理-腐生-共生营养型占比较高,分别为23.63%~61.87%和13.93%~34.13%。不同窖泥样品真菌的主要营养类型不同,样品DWPM10、DWPM50、BPM50的真菌以病理-腐生-共生营养型为主,样品UWPM10的真菌则以共生营养型为主,其他样品的真菌则以腐生营养型为主。从图9b可以看出,不同窖泥样品真菌的主要生态功能群也存在差异,样品UWPM10真菌功能类群主要是未定义的腐生菌(20.55%)和外生菌(15.88%),其中未定义腐生菌在属水平上包括
Pseudeurotium
Monascus
Wickerhamomyces等,外生菌在属水平上包括
Inocybe
Russula等。样品MWPM10和DWPM10真菌功能类群中未定义的腐生菌相对丰度分别高达33.20%和30.64%,是样品MWPM10和DWPM10中最主要的功能类群,在门水平上主要有Ascomycota、Basidiomycota、Mucoromycota;样品MWPM10和DWPM10中,动物病原-内生-寄生性真菌-地衣寄生虫-植物病原-木质腐生菌类群也是主要功能类群,相对丰度分别达4.61%和4.46%,其在属水平上包括
Nectria
Penicillifer等。样品BPM10和DWPM50真菌功能类群主要是未定义的腐生菌和植物病原菌,其中植物病原菌在样品BPM10和DWPM50相对丰度分别达11.85%和13.40%。样品UWPM50和MWPM50主要的功能类群为未定义的腐生菌(相对丰度分别为56.72%、22.71%)和内生植物病原菌(相对丰度分别为9.79%、22.49%),内生植物病原菌在属水平上的主要真菌属为
Thermomyces等。样品BPM50中除最主要的功能类群未定义的腐生菌外,动物病原-内生-寄生性真菌-植物病原-木质腐生菌也是主要的功能类群,相对丰度为17.79%,在属水平上的真菌属包括
Acremonium
Sodiomyces。总之,金徽酒窖泥的真菌群落主要有7 种营养类型和11 个功能类群,但不同样品的真菌营养类型和功能类群因其窖龄和空间位置不同而存在差异。
结 论
在所有金徽酒窖泥样本中,Ascomycota、Basidiomycota、Rozellomycota、Mortierellomycota是窖泥的优势真菌门,
Aspergillus
Monascus
Kazachstania等14 个属为优势真菌属;同时在属水平上检测到25 种差异真菌,且不同窖龄窖池和空间位置窖泥的差异真菌组成存在明显差异。尽管不同窖龄窖池和空间位置窖泥的真菌多样性和丰富度变化趋势不同,但总体而言50 a窖龄窖泥更趋于稳定。RDA结果表明金徽窖泥的pH值、水分、腐殖质、K + 和Ca 2+ 等理化特性对真菌群落的分布影响较大,尤其是区分不同窖龄的窖泥样品。通过网络分析发现金徽酒窖泥中真菌群落同生网络的中心为
Aspergillus
Russula
Sebina
Mortierella
Archaeorhizomyces,并且发现4 个独立的模块,表明枢纽是影响整个环境微生物菌群网络的重要因素。FUNGuild功能预测结果表明金徽窖泥的真菌群落有7 个营养类型和11 个生态功能类群,且不同窖泥样品真菌的营养类型和生态功能类群存在差异。总之,通过研究不同窖龄窖泥真菌群落结构多样性与空间异质性,发现不同窖龄窖池窖泥的优势真菌属存在较大差异,也证实了窖池中窖泥真菌群落具有明显的空间异质性,对进一步探索不同空间位置窖泥真菌群落对窖泥老化和酒体风味物质形成的具体贡献有积极作用。
本文《 基于高通量测序技术分析不同窖龄窖泥真菌群落多样性与空间异质性》来源于《食品科学》2023年45卷第2期178-187页,作者:任海伟,李志娟,刘美琪,蔡早宁,孙一帆,郭晓鹏,范文广,张丙云,李彦涛,尉军强。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230329-297。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑:王雨婷 ;责任编辑:张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。
图片来源于文章原文及摄图网。
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