AM | 一种具有超高破裂压力和天然抗菌活性的可注射水凝胶用于紧急止血和伤口修复

严重创伤后不受控制的出血和伤口感染对现有的组织粘接剂构成了重大挑战，主要是由于它们的湿粘连弱、粘连形成缓慢、细胞毒性问题以及缺乏抗菌性能。本文研制了一种以ε-聚赖氨酸和聚乙二醇衍生物为基础，具有快速、牢固的粘接密封和固有抗菌活性的可注射水凝胶(简称ES凝胶)。该工程水凝胶具有快速凝胶行为、高机械强度、与各种组织的强粘附性，并能承受450 mmHg的超高破裂压力。它还具有优异的生物相容性，生物降解性，抗菌性和按需去除性。在大鼠和家兔的各种损伤模型中，与纤维蛋白胶相比，ES凝胶的止血效果明显改善。值得注意的是，粘接水凝胶可以有效阻止全抗凝猪内脏器官(肝、脾、心)和股动脉损伤模型的致死性不可压缩性出血。此外，水凝胶在大鼠肝缺损、皮肤切口和感染全层皮肤伤口模型中的无缝线缝合和修复效果优于市售产品。总的来说，本研究强调了ES凝胶在治疗不受控制的出血、无缝合线伤口闭合和感染伤口修复方面的临床应用前景。

ε-聚赖氨酸(ε-polylysine, EPL)是一种天然阳离子多肽，具有良好的水溶性、生物相容性、生物降解性和固有的广谱杀菌作用。EPL中容易获得的胺基促进其交联反应成水凝胶。这些特性结合在一起，使EPL成为开发新型抗菌生物粘合剂配方的有前途的基石。以前，我们报道过四臂聚乙二醇和PEG/明胶密封剂用于出血控制。虽然上述的黏着性水凝胶可以实现有效的止血，但所使用的材料及其相关的抗菌性能、伤口愈合评估和潜在的机制尚未得到充分的优化，以满足临床挑战，例如修复感染伤口。

在这项工作中，我们描述了一种新型的可注射和生物相容性粘合剂水凝胶，具有固有的抗菌活性，用于无缝线止血密封和伤口修复。该工程黏附水凝胶名为ES凝胶，由EPL和美国食品药品监督管理局批准的四支聚乙二醇琥珀酰酰琥珀酸酯(tetrai - peg - ss)(方案1)组成。通过EPL和生物组织中丰富的活性NHS酯基和胺基之间的自发共价交联，可以在生理条件下快速自凝胶，同时在各种湿组织上形成强粘附。形成的琥珀酰酯键使水凝胶能够生物降解和按需去除。我们系统地表征了ES凝胶的凝胶过程、组织粘附性、机械强度和破裂压力，以优化胶粘剂配方。然后，通过全面的体外和体内试验对水凝胶的生物相容性和生物降解性进行评价。水凝胶对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌性能进行了评估。随后，用小动物和全抗凝猪的各种内脏器官和股动脉损伤模型验证其止血效果。此外，我们在大鼠肝缺损、皮肤切口和感染全层皮肤伤口模型中，与市售产品相比，展示了水凝胶在体内无缝线伤口闭合和愈合的效果。并对伤口愈合的可能机制进行了探讨。

为了验证所提出的设计策略，根据我们之前的报道，首先合成了Tetra-PEG-SS，并使用1H-NMR和FT-IR光谱确认了其化学结构(图S1和S2，支持信息)。然后将等体积的EPL和tetrao - peg - ss溶液混合在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备ES凝胶。在生理条件下，tetrao - peg - ss中的NHS酯与EPL中丰富的氨基发生自发快速反应，无需任何催化剂即可形成透明的水凝胶。ES凝胶的凝胶化过程可由前驱体浓度控制。通过保持EPL浓度不变，增加Tetra-PEG-SS组分与凝胶时间的减少相关，这主要是由于可用于交联的反应位点数量增加(图1a)。当EPL/ teza - peg - ss浓度为5/20% (w/v)时，凝胶时间达到最小值5.0 s(图S3a，辅助信息)，进一步将teza - peg - ss含量增加到30% (w/v)时，凝胶速度并没有加快(5/30%，w/v时为5.1 s)。因此，本研究选择浓度为20% (w/v)的tetrao - peg - ss制备水凝胶。此外，当EPL含量从1.0增加到20% (w/v)时，我们发现所得水凝胶的凝胶时间相应减少，在5% (w/v)时达到最小值，然后逐渐增加。在聚合物浓度高得多的情况下，凝胶速率的下降可归因于两种组分的混合和交联不足，这是由过高的粘度造成的。我们进一步进行了动态时间扫描测试，以获得有关凝胶化过程中流变行为的信息。所有样品都表现出从流体到水凝胶的转变，表明在混合前驱体溶液后，存储模量(G ')大幅增加，并且超过了损失模量(G″)(图S4，支持信息)。EPL含量为5% (w/v)的水凝胶到达凝胶点的时间最短(5.0 s)，再次证实了其最快的凝胶速率(图S4c，配套信息)。通过ATR-FTIR光谱中1740、1640和1102 cm−1处的特征吸附带的存在验证了ES凝胶的化学结构，这些特征吸附带分别对应于O─C = O、酰胺和C─O─C基团

体外ES凝胶的凝胶行为、力学和组织粘附性能。a) ES凝胶凝胶化时间与前驱体浓度(EPL和Tetra-PEG-SS)的关系(n = 3)。b)不同EPL浓度(20% (w/v) Tetra-PEG-SS)下ES凝胶的储存模量(G′)和损失模量(G″)。c - e)用20% (w/v) tetrao - peg -SS和市买纤维蛋白胶(n = 6)在不同EPL浓度下制备的ES凝胶的压应力(c)、平均抗剪强度(d)和破裂压力(e)。f) ES凝胶的破裂压力和凝胶时间与已报道的原位可注射黏附水凝胶的比较，包括PFN2H1、[5]HA-PEG、[5]GelMA/HA-NB、[10]SS、[18]AG-PEG、[18]COP、[20]CoSt、[21]SN-ZF、[22]A7C3、[23]LZM、[24]HACN-PEG、[25]OPEG-AG-G。[26]红星代表ES凝胶。g)密封后的猪心脏和胃(分别填充红色染色PBS和模拟胃液)浸泡PBS后的照片，以证明密封的稳定性(比例尺:5厘米)。h,i)水凝胶与湿器官组织粘附界面的代表性SEM (h)和H&E (i)染色图像。数据以均数±标准差表示(ns =无统计学意义，p < 0.01, p < 0.0001)。

ES凝胶的生物相容性及抗菌效果。a,b) 3T3细胞与水凝胶提取物孵育不同时期后的细胞活力(a)和代表性活/死染色图像(b) (n = 8，比例尺:200µm)。c) ES凝胶(20.0 mg mL−1)、PBS(阴性对照)和Triton X-100(阳性对照)的溶血活性测定和溶血率照片(n = 5)。d) ES凝胶在PBS中的体外降解曲线(n = 4)。e)植入cy5.5标记的水凝胶在体内的代表性荧光图像以及降解产物在1、2和3天在主要器官中的生物分布(比尺:5 cm)。f)皮下植入试验第3,7,14天植入的水凝胶和周围组织的代表性H&E(左)和Masson三色(右)染色图像。星号代表炎症细胞，三角形代表正常组织(标尺:1mm)。g)水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌抑菌率的统计分析(n = 4)。h)经ES凝胶处理或不经ES凝胶处理的细菌在琼脂板上生长的照片(比例尺:5 cm)。i)细菌与ES凝胶共培养后的SEM图像(比例尺:5µm)。箭头表示破裂的细菌膜。j) ES凝胶的抗菌机理示意图。数据以平均值±标准差表示

ES凝胶在大鼠肝缺损模型中的体内止血和伤口愈合过程。a)纱布组、ES凝胶组和纤维蛋白胶组在大鼠肝损伤模型中的出血和止血过程的代表性图像(比例尺:10 mm)。b,c)止血时间和不同止血方法的累积出血量比较(n = 5)。d)第7天和第14天修复肝脏的代表性照片(比例尺:2 cm)。e)修复后肝脏第7天和第14天的组织粘连平均评分，采用双盲评分法(n = 3)。f)纱布、纤维蛋白胶和ES凝胶处理后7天和14天的损伤肝组织H&E染色代表性图像。g,h)火山图分别表示ES凝胶组和纤维蛋白胶组在第7天(g)和第14天(h)的deg。黑色、蓝色和红色的点分别代表不显著、下调和上调的基因。i,j)第7天(i)和第14天(j) deg的KEGG途径富集分析。数据以均数±标准差表示(ns =无统计学意义，p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001)。

DOI: https://doi.org/10.1002/adma.202404811

来源：Ivy Nano Medicine