免疫机制的多样性与TLR4在LPS识别中的关键作用

在哺乳动物体内发现至少存在10种TLRs分子，为何机体内存在多种TLRs？现已研究证实，这是由于宿主识别不同微生物的需要而形成的免疫机制，如在果蝇，Toll家族不同成员参与对不同病原菌的防御作用：Toll主要介导抗真菌反应，18-Wheeler拮抗细菌感染。哺乳动物TLRs家族不同成员对微生物及其PAMPs的识别作用也存在相对的特异性。表7-3显示TLR家族成员不仅识别脂质和多糖（如LPS、肽聚糖），而且也与细菌或病毒DNA、RNA和蛋白质作用。

TLR4是研究最早、作用也最为明确的TLR分子。除细菌LPS外，近年来也发现了其他一些配体，如抗肿瘤药物泰素﹑热休克蛋白60（hsp60）等。识别的病原菌主要有革兰阴性菌、厌氧菌、致密螺旋体。有人认为，TLR4还能识别病毒融合蛋白（respiratory scyncytial virus，RSV），但该研究采用的动物是C57BL/10ScCr小鼠，这种小鼠体内同时缺失Tlr4和IL-12受体β2链基因。由于1L-12是天然免疫和适应性免疫拮抗病毒感染的关键细胞因子，以及C57BL/10ScCr小鼠对IL-12，无反应。因此，TLR4对RSV的识别作用尚待探讨。

TLR4虽能识别多种配体，但主要配体是细菌LPS，同CD14分子一样，作为一种重要的LPS兴奋性受体，在介导革兰阴性细菌及其LPS的宿主反应中发挥重要作用。研究结果显示，将TLR4基因转入不表达TLR4的细胞内，可使不具有LPS反应的细胞具有一定的LPS反应性。相反，将LPS反应细胞内的TLR4基因进行突变或缺失，细胞则出现LPS低反应性或耐受。抗TLR4抗体能抑制不同血清型肠道杆菌LPS刺激人THP-1细胞释放TNFα的作用，但对肽聚糖、热灭活金黄色葡萄球菌等无抑制作用。

此外，TLR4胞外区和胞内区的点突变也显示与人呼吸道LPS低反应性有一定的内在联系。骨髓移植病人自身或供者tlr4基因胞外区缺陷人群中，骨髓干细胞移植后革兰阴性脓毒症的发生率为16.7%，而正常TLR4的受者中，其感染的发生率为6.6%，提示TLR4胞外区的突变可增加内毒素血症的危险性。

然而，最能说明TLR4作为LPS重要受体的是近年来关于Lps基因的研究。1978年，James Watson首次提出小鼠体内可能存在控制LPS反应的特定基因，取名为Lps，认为该基因可能有两个等位基因：即Lpsd（defective response〉和Lpsn（normal response）。三种天然LPS低反应小鼠品系C3H /HeJ、C57BL/10ScCr和C57BL/10ScN的Lps等位基因为Lpsd，表现为对LPS刺激的耐受性。James Watson等通过基因作图将Lps基因座定位于小鼠4号染色体上。20世纪90年代以来，随着分子生物学技术的快速发展，先后有多个研究小组采用定位克隆策略，对Lps基因座重新进行精细作图，绘制出围绕Lps基因座染色体区的高分辨连锁图，最终将Lps基因座定位于0.9 cM、1.7~2.6Mb长的片段内。

为了进一步明确Lps基因座内的候选基因及其编码蛋白，1998年Poltorak等对该重要区域进行高密度测序（近4万次），以及利用外显子捕获﹑选择性原位杂交和定位克隆等技术，在其区域内鉴别出多个基因，如TLR4基因、锌脂蛋白基因、Tera同构体基因、大部分Pappa基因序列（编码一种分泌型金属蛋白酶）、芳香乙酰胺脱乙酰基酶基因和astrotactin同构体基因，Tlr4是唯一与LPS作用有关的基因，Tlr4全长基因都位于Lps基因座内。其他学者也获得同样结果。

进一步研究显示，C3H/HeJ小鼠Tlr4cDNA的第2342位，即第3个外显子上出现一个碱基颠换：C→A。在LPS反应品系小鼠基因组DNA中未发现相应的碱基突变。此外，C3H/HeJ、C3H/HeN、C57BL/10ScSn小鼠巨噬细胞均能检测出Tlr4 mRNA，但不能检测出C57BL/10ScCr小鼠巨噬细胞的Tlr4 mRNA。上述结果说明，C3H/HeJ小鼠Tlr4为点突变，其突变并不影响Tlr4的转录，C57BL/10ScCr小鼠Tlr4基因则为完全缺失，即为无效等位基因（null allele），有74723个核苷酸缺失，这包括了该基因的所有三个外显子，因而出现隐性突变。由于Tlr4位于Lps内，两种LPS耐受株小鼠的Tlr4基因均发生错义突变（missensemutation）或缺失，进一步证实Tlr4基因就是Lps的最佳候选基因。

进一步研究显示，T1r4基因的突变具有重要的功能意义。C3H/HeJ小鼠Tlr4基因第3个外显子上的点突变虽不影响该基因的转录，但因其密码子的变化，使蛋白氨基酸序列上第712位高度保守的脯氨酸（proline）变为组胺酸（histidine）。该区域正为蛋白质的胞浆区，该胞浆区为进化中最保守的结构域，其结构域的完整性对于通过TLRs介导的LPS信号至关重要。这种氨基酸残基的替换改变了TLR4信号转导区域的拓扑结构，进而破坏了与下游分子蛋白一蛋白间的相互作用，从而表现出对LPS信号转导的共显性抑制作用。C57BL/10ScCr小鼠因Tlr4基因完全缺失，不能表达TLR4蛋白，因而出现对LPS反应的隐性消失（recessive abolition）。由此可见，C3H/HeJ和C57BL/10ScCr的突变表型分别与Tr4点突变或基因缺失非常吻合。