疫苗前沿 | 风疹病毒BRDⅡ减毒株E1区连续传代稳定性研究

中文摘要

目的评估风疹病毒BRDⅡ减毒株（BRDⅡ株）E1区在人二倍体细胞2BS株（2BS细胞）中的连续传代稳定性。

方法将BRDⅡ株28代病毒在2BS细胞中连续传10代分别获得第29—38代病毒，依据中国药典2020年版三部对不同代次病毒进行生物学特性检测，将28代病毒（主种子批）、31代病毒（工作种子批）以及38代病毒进行全基因测序后对其核苷酸序列进行分析比对。

结果BRDⅡ株28代病毒在2BS细胞中连续传10代，其细胞病变程度基本稳定。基因测序发现，结构蛋白E1区第8281nt位点共出现1个突变，为同义突变。

结论BRDⅡ株在2BS细胞中自28代连续传至38代，病毒蛋白主要功能区E1区的氨基酸序列高度保守，具有良好的传代稳定性。

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正文

风疹是由风疹病毒引发的急性呼吸道传染病，目前暂无特异性治疗药物，但可通过接种疫苗有效预防。风疹病毒BRDⅡ减毒株（BRDⅡ株）由北京生物制品研究所有限责任公司（北京公司）从患儿体内分离，于1985年被批准用于生产风疹减毒活疫苗。人二倍体细胞2BS株（2BS细胞）因无致癌性，无外源因子污染，且细胞性状较稳定，被广泛应用于各种人用疫苗的研发与生产。

毒种的传代次数对于减毒活疫苗的安全性、有效性和高产性至关重要，中国药典2020年版三部（药典三部）规定BRDⅡ株原始种子批为25代，主种子批应不超过28代，工作种子批应不超过31代，生产疫苗的代次应不超过32代，以控制因传代次数过多而引发的基因突变。对于种子批遗传稳定性评估，通常为自主种子批代次起至少超过疫苗病毒代次5代以上。包膜（envelope，E）1蛋白编码区（E1区）编码的E1蛋白是风疹病毒引起免疫应答的主要糖蛋白。本研究将BRDⅡ株28代病毒在2BS细胞上连续传10代，并将28、31及38代病毒进行全基因测序，观察其核苷酸序列在E1区是否出现突变，并与其他点位突变进行分析比较，探讨BRDⅡ株E1区在2BS细胞中连续传代稳定性。

1

材料与方法

1.1

毒种及细胞

BRDⅡ株主种子批为28代，来自北京公司，由原始种子批25代在2BS细胞上连续传代3次获得；2BS细胞来自北京公司，由21代冻存工作细胞库经复苏传代获得，为28—36代。

1.2

主要试剂

RNA病毒提取试剂盒（DP315-R）购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒TaKaRa PriMeScript™ⅡHigh Fidelity RT-PCR Kit（Takara Code No.R023A）、PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase （Takara R050A）试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0（Code No.9762）均购自日本Takara公司。

1.3

病毒液制备与检定

将BRDⅡ株28代主种子批按照感染复数0.01~0.10接种到2BS细胞中，于（30±1） °C静置培养3 d后，更换风疹病毒维持液，继续培养3 d后收获29代病毒液。按照此方法连续传10代，获得29—38代病毒。根据药典三部要求，对28—38代病毒进行无菌检查、病毒滴定、鉴别试验和支原体试验。

1.4

引物合成与设计

选择GenBank数据库中的AY258323.1作为风疹病毒参考基因，使用Primer 5.0软件设计引物。将风疹病毒全基因组序列分为13个片段进行扩增（图1）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。

1.5

目的基因扩增

使用DP315-R提取28、31及38代病毒收获液总RNA，取1 μg为模板，Random 6 Mers/Oligo dT Primer为反转录引物，反转录成cDNA。反应体系：1 μg总RNA，1 μl dNTP Mixture，1 μl Random 6 Mers，1 μl Oligo dT引物，RNase Free ddH2O补足至10 μl。65 ℃反应10 min，冰上放置2 min。取10 μl上述反应液、4 μl 5×PrimeScript Ⅱ Buffer、1 μl PrimeScript Ⅱ RT Enzyme Mix、5 μl RNase Free ddH2O，30 ℃反应10 min，42 ℃反应30 min，70 ℃反应15 min，获得cDNA。以cDNA为模板，应用设计的引物分别进行扩增得到13个DNA片段。反应体系：1 μl cDNA，10 μl 5×PrimeSTAR® GXL Buffer（Mg2+ Plus），4 μl dNTP Mixture（均为2.5 mmol/L），1 μl正向引物（20 μmol/L），1 μl反向引物（20 μmol/L），0.5 μl PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase，32.5 μl ddH2O。预变性95 ℃ 5 min，变性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 2 min，35个循环。将获得的产物置于4 ℃保存。

1.6

目的基因的纯化及基因组序列测定

取不同代次的上述13个PCR产物各5 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化DNA片段并去除样品中基因组DNA的污染，然后进行测序。将各代次扩增片段按照相同的体积混匀后上样，使用Illumina HiSeq 2000平台进行二代测序。通过对原始测序数据进行过滤去掉其中未知碱基、接头片段以及测序数据中过低的数据，获得高质量的测序数据，再与风疹病毒AY258323.1参考基因全基因组序列进行比对，将比对到的测序数据进行拼接组装得到测序转录组数据。

2

结果

2.1

传代细胞与不同代次病毒生物学特性鉴定

将BRDⅡ株28代主种子批在2BS细胞中连续传代10次，镜下观察细胞生长为致密单层，形态饱满，呈纤维状，排列紧密。图2中各代细胞生长情况基本一致，不同代次病毒收获前细胞病变程度基本相同，达25%，滴度为5.7~6.0 lgCCID50/ml，无菌检查、支原体检查、鉴别试验全部合格。

2.2

PCR产物鉴定

使用上述相同的13对引物分别对28、31、38代病毒进行扩增，将其基因片段PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，1一13、14—26、27—39泳道分别为28、31、38代病毒基因片段的扩增产物。如图3所示，各代次获得的产物大小位置相同，片段大小符合预期。通过胶回收对其进行全基因组测序，片段大小均符合预期。

2.3

不同代次病毒基因测序比对结果

使用DNAMAN软件对风疹病毒参考基因与28、31、38代病毒全基因组序列进行比对，E1区仅出现1个同义突变，其他蛋白编码区共出现6个突变位点。不同代次基因的变化见表2。

2.3.1 开放阅读框（open reading frame，ORF）1对比风疹病毒参考基因，3个代次病毒在6021nt位点出现1个突变C→T，由丝氨酸变为苯丙氨酸，位于病毒P90非结构蛋白编码区，该区域与病毒基因复制相关，不在调控功能的结构域内。

2.3.2 衣壳（capsid，C）蛋白3个代次病毒相对于风疹病毒参考基因，在第7050nt位点出现1个突变，碱基G→C，由精氨酸变为脯氨酸。该蛋白虽然在空间结构上参与成环，但不属于关键位点。

2.3.3 E2蛋白对比风疹病毒参考基因，3个代次病毒在7633nt位点出现1个突变C→T，为同义突变；在8083nt位点出现1个突变T→C，为同义突变；在8224nt位点出现1个突变G→C，为同义突变。第38代病毒E2蛋白编码区在8012nt位点出现1个突变G→C，由丙氨酸变为脯氨酸。E2蛋白免疫原性较弱，244至263位氨基酸能诱导机体发生免疫应答。在E2蛋白编码区的4个突变位点中3个为同义突变，1个位于501位氨基酸，不在免疫应答区域。通过研究各代次病毒滴度结果发现，此处突变并未对病毒感染造成影响。

2.3.4 E1蛋白对比风疹病毒参考基因，3个代次病毒在8281nt位点出现1个突变C→T，为同义突变，表明BRDⅡ株在2BS细胞中E1区连续传代具有良好的稳定性。

3

风疹病毒的基因组全长为9 762个核苷酸，包含2个ORF，位于5'端的ORF1在基因序列41—6391nt位置，编码病毒的非结构蛋白；位于3'端的ORF2在基因序列6512—9703nt位置，编码病毒的结构蛋白，包括E1（8258—9700）、E2（7412—8257）、C蛋白（6512—7411）。E1与E2在病毒表面形成刺突，E1具有中和表位和抗原表位，C蛋白组成病毒壳体。风疹病毒有1个血清型但有十几种基因型，基因型的改变不会引起抗原的变化。

强毒株可通过在细胞中低温传代减弱病毒效力，由于RNA病毒的低保真性导致在连续传代过程中易发生基因突变，可能会使合成蛋白质的功能性更强，因此减毒活疫苗的稳定性至关重要。减毒活疫苗的病毒通常为不均一的混合物，通过扩增以及基因测序往往得到的是混合物中优势病毒序列，在测序过程中更应该关注连续性核苷酸序列的稳定突变以及相应的氨基酸变化。风疹病毒基因组中GC含量高达70%，密码子具有偏向性，所有优选的密码子都以C或G结尾，风疹病毒中定向突变为C或较小程度突变为G是氨基酸与密码子选择的驱动因素。

本研究在连续传代过程中发现3个核苷酸的突变影响了氨基酸序列的改变，分别位于ORF1、C蛋白、E2蛋白。E1蛋白是跨膜糖蛋白，是组成风疹病毒外膜刺突的重要结构，是诱导机体发生免疫应答以及病毒感染的重要分子。E1蛋白在病毒的翻译、组装以及释放过程中发挥重要作用，若该区域突变会导致结构蛋白停留在内质网，影响病毒的组装与释放。E1蛋白具有3个糖基化位点和1个疏水区，该位点对于形成抗原表位与蛋白质正确折叠至关重要。在本研究的连续传代过程中3处氨基酸突变位点均未在E1区。

研究结果表明，BRDⅡ株在2BS细胞中自28代连续传代至38代，不同代次病毒收获前细胞病变程度相同，滴度稳定，无菌检查、支原体检查、鉴别试验全部合格。各代次病毒扩增产物片段大小符合预期。基因测序结果表明，风疹病毒E1区具有良好的传代稳定性，在一定程度上为风疹疫苗及其联合疫苗的安全性与有效性提供参考依据。

作者

简哲 李欣娜 刘爽 杨天石 李杨 孙雅 王刚 邱梅

北京生物制品研究所有限责任公司疫苗一室，北京 100176

通信作者：邱梅，

Email：15222625912@163.com

引用本文：简哲, 李欣娜, 刘爽, 等. 风疹病毒BRDⅡ减毒株E1区连续传代稳定性研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(2): 67-71.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230330-00029

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撰写| 国际生物制品学杂志

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice