多抗药物技术学习（一）

1、前言

多特异性抗体可识别多个抗原表位，这些表位可位于想通或不同的靶点，多重识别能力拓展了单抗药物的潜力，可实现更多的治疗机制以及更多的疾病治疗。

多抗识别多表位的能力得益于蛋白工程的发展，本质上是利用蛋白工程的手段，对不同的结构模块进行组装，以实现抗体的多种功能。影响多特异性抗体的因素包括抗体大小、结构、价态、灵活性和各模块的空间位置及可开发性、体内分布和药代动力学属性等。这些因素使得多抗药物的开发非常复杂和困难，虽然有数百条管线处于临床开发阶段，但迄今只有不超过10个获批。

本文对多特异性抗体的结构模块和组装技术进行学习，希望对大家有所帮助。

2、结构模块

多抗的设计基于对多模块的组装，这些模块包括天然结构和人工合成结构。天然结构包括片段抗体 (Fab)、单链可变区(scFv)、抗体恒定区(Fc)、单域抗体 (VHH) 和细胞因子等；人工合成的结构包括人造小蛋白片段等。

图注：多抗结构及模块示意图。A，多抗的组装结构；B，组装多抗的模块及对应的分子特征。

对处于临床试验阶段的约300个多抗药物分析发现，83%的药物包含Fc 区， 58%包含Fab，有38%包含scFv，14%包含细胞因子，10%包含VHH，还有小部分药物包含其他的结构模块。（见下图）

2.1 Fab模块

Fab由重链的可变区和CH1及整个轻链（VL和CL）组成，是一个100个残基构成的稳定异二聚体。多种分子间的力参与了其结构的稳定，包括氢键、盐桥、疏水相互作用和范德华力。

图注：IgG的结构以及Fab和scFv的结构

由于Fab易溶于水，结构稳定，是多抗组装的最常用组件，尤其是高浓度制剂和/或皮下给药制剂。但Fab需要两条不同的多肽链组装，CH1和CL必须正确同源配对，在实际生产中经常产生错配，可产生多达10 个不同的错配结构，因此科学家们设计了许多工程策略来强制进行正确的链配对如：电荷配对突变 (CPM)、旋钮进孔(KiH)、单链Fab (scFab) 等。

2.2 单链抗体(scFv)

scFv是通过Linker把重链可变区(VH) 和轻链可变区 (VL) 连接而成的分子，其大小约为Fab的一半（~25kDa），且为单条多肽链表达，错配概率大大降低。但由于缺少恒定区，所以恒定区的二硫键也不存在，因此结构相对不稳定。scFv可通过多种linker串联到Fc的N和 C 末端，形成2~4倍的多价抗体。

由此可见对scFv结构有影响的是Linker和VH-VL的连接方向和方式。多种Linker已在临床成功应用，最常见的是(Gly4Ser)3，当然也可以按照需求定制更刚性的，甚至带静电荷的linker。二scFv的连接方式也是多种多样。

图注：scFv的结构连接示意图

由于缺乏二硫键，scFv稳定性较低，另外，由于缺少恒定区，增加了暴漏在溶剂中的可变区的氨基酸，会导致聚集。含有scFv的多抗，在相同浓度下，相对于单抗的聚集度要高，这也限制了这类药物的开发。

scFv应用的典型案例是Amgen的BiTE平台，该平台使用双scFv串联的药物。第一个药物是Blinatumomab，于2014年获FDA 批准。

图注：Blinatumomab原理示意图

2.3 VHH结构

骆驼科动物和鲨鱼天然产生重链抗体，其抗原结合区由单个重链可变结构域 (VHH) 组成，这也是构建多抗的重要模块。VHH为单体结构，大小约12–15 kDa，无需像Fab 那样进行同源配对，也无需像 scFv 那样需要linker，因此在多抗的组装中具有巨大优势。

另外VHH具有理想的可开发性，包括高产量、高浓度下低聚集、高热稳定性和低粘度等。由于及佳的生物物理特性，VHH也可通过吸入方式给药。

基于VHH的第一款药物是FDA于2019年批准的Caplacizumab，此后有近几十种含有VHH的多抗已进入临床开发阶段。

2.4 Fc片段

Fc是IgG的片段，由两条肽链异二聚化而成。为保证正确配对，Fc的两种常用方法是使用旋钮-孔 (KiH) 突变和CPM。

KiH突变会在一条链上引入空间体积大的氨基酸（如色氨酸或酪氨酸），在另一条链上引入小氨基酸（如甘氨酸或丙氨酸），分别形成突起和口袋，类似于榫卯结构。虽然这种方法对于减少同型二聚体特别有效，但孔-孔同型二聚体仍会形成，必须通过额外的纯化步骤将其与所需的异型二聚体分离。

图注：KiH技术原理

CPM技术通过在一条链上引入带正电荷的残基，在另一条链上引入带负电荷的残基，以利于异二聚体的形成。在这种情况下，具有相同电荷的链会互斥，而相反电荷的链有利于异二聚体的形成。

图注：Fc的效应功能

在生产上，Fc具有高表达、易通过Protein A捕获纯化和高溶解度的优点。此外，Fc可以识别多种细胞表面受体起到免疫反应和延长抗体半衰期的功能。如，可与Fcγ 受体家族(FcγR) 相互作用，引发抗体依赖的细胞毒作用或抗体依赖的吞噬作用。和新生儿Fc受体(FcRn) 结合通过内体循环，延长蛋白半衰期。C1q还可以与Fc结合，激活补体系统，最终通过形成膜攻击复合物产生补体依赖性细胞毒性。

2.5 细胞因子模块

免疫系统通过分泌细胞因子进行调控，这些细胞因子大小通常小于30kDa，每种细胞刺激的细胞各不相同。把细胞因子作为模块设计在多抗药物上，可以起到许多生物学功能，如平衡癌症免疫治疗和许多自身炎症疾病中失衡的炎症状态。

图注：细胞因子构建的抗体示意图