浙大连佳长团队构建血根碱及其衍生物完整生物合成途径

抗生素的大量使用引发了抗生素耐药性，这已经成为对目前全球卫生、食品安全和发展最大的威胁之一。因此领域内需要寻找对环境和人类健康更友好的抗生素替代品，比如血根碱。

这是最重要的苄基异喹啉生物碱（BIA）之一，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。作为饲料添加剂，血根碱在猪、禽等饲养中可以替代抗生素，取得良好的效果。不过，血根碱共轭结构复杂，多年来血根碱的生产仍然依赖于从多年生草本植物博落回提取、且在植物中的丰度低，这一定程度上阻碍了其广泛应用。

利用合成生物学技术在微生物底盘中重构血根碱的生物合成途径是一种极具前景的方法。不过，在实际生产中，也需要解决生物合成效率低下、存在多个瓶颈以及许多天然产物具有强细胞毒性等挑战。

在此背景下，近日，浙江大学化学工程与生物工程学院连佳长团队在工程化酵母菌株中构建了血根碱及其卤代衍生物的完整生物合成途径。在研究中，他们建立了一种内含肽剪接介导的温度响应基因表达系统（SIMTeGES），并结合蛋白工程等方法增强工程酵母内源代谢通量、降低细胞毒性。经过全面的代谢工程改造，最佳工程化酵母菌株生产血根碱的滴度达到了 448.64 mg/L。此外，工程化菌株还可以生物合成卤代衍生物氟化血根碱，合成的生物催化步骤超过 15 步。

论文中指出，这项工作为利用酵母作为生物合成多种苄基异喹啉生物碱及其衍生物的通用平台铺平了道路，尤其是具有细胞毒性的天然产物。

此前，该团队通过将 24 个表达盒稳定整合到酵母中已经实现了血根碱的从头生物合成，但血根碱的生物合成途径复杂以及存在细胞毒性对生物制造提出了挑战。血根碱生物合成途径复杂的主要原因在于涉及 6 种细胞色素 P450、4 种甲基转移酶和 2 种黄素蛋白氧化酶，这些植物源的酶在酵母中可能相容性差。

而通过动态途径工程将细胞生长和产物合成分开处理是一种解决天然产物积累导致代谢负担或细胞毒性的有效策略。在酵母中，比较成功的案例是建立温度响应的 GAL 调控系统，通过定向进化可以得到突变体 GAL4M9。不过，该系统也存在阻碍植物次生代谢物产生且仅限于受 GAL 启动子控制的靶基因表达等问题。

因此，需要开发一种可维持任何目标基因最大表达且协调细胞生长和产品积累的温度响应系统非常关键。在这项研究中，该团队设计了一种内含肽剪接介导的温度响应型基因表达系统（SIMTeGES），并筛选出 GAL4 突变体 GAL4-dINT，利用温度作为输入信号将细胞生长与血根碱生物合成分离开。还探索了 SIMTeGES 的分子机制和在不同酵母中的普遍适用性。

他们将温度依赖性内含肽剪接变体插入 GAL4 DNA 结合域，成功将 GAL 系统的解耦信号从高浓度葡萄糖重置为温度。在非允许温度下 30°C，内含肽保持未剪接状态，阻止 GAL4-tsINT 结合到特定 DNA 区域并激活下游 GAL 启动子表达，从而引导可用资源用于细胞生长；达到特定生物量后，过渡到允许温度 25°C 会诱导内含肽自我剪接，从而产生功能性 GAL4， 以启动下游基因表达并从细胞生长过渡到产物合成。研究显示，SIMTeGES 系统不仅可以保持靶基因高表达，还建立了更严格且易于控制的生长和生产解耦系统，更适合复杂的植物次生代谢物的生物合成。

接下来，研究团队提出 SIMTeGES 可作为一种有前途且有效的血根碱生物合成策略，能够缓解开发高产血根碱生产菌株的难题。该团队将两个温度响应型 GAL 系统整合到血根碱的生产菌株 SAN219 中，从而构建了两株新菌株 SAN220-tsINT 和 SAN220-M9。通过添加不同的碳源测试血根碱滴度，他们发现 SIMTeGES 将葡萄糖替换为温度并作为解耦信号可有效缓解对合成途径的限制，同时也不会牺牲异源基因表达水平。此外，在酵母菌株 SAN220-tsINT 连续传代五次后，观察到血根碱滴度相对稳定，这表明血根碱细胞毒性引起的菌株稳定性得到缓解。

随后，该团队进行了全面的转录组分析，重点关注参与中心碳代谢和异源途径的基因簇，研究不同碳源下血根碱产量显著变化的根本原因。在温度作为唯一的解耦信号条件下，研究发现进一步支持了在 GAL 系统中使用甘油和半乳糖作为混合碳源具有积极作用。

识别和消除限速步骤对于构建高效的微生物细胞工厂至关重要，对于复杂且长的生物合成途径尤是如此。该团队通过信号肽截断和 MBP 融合表达增强黄素蛋白小檗碱桥酶（BBE）在酵母细胞质中的溶解度；使用跨膜结构域工程策略正确表达和定位原阿片碱 6-羟化酶（P6H），这种策略为增强酵母细胞色素 P450 酶在体内的活性提供了更多证据。

解决该途径中的两个关键限速步骤后，研究团队将重点转移到增强前体供应、辅因子工程和细胞解毒能力，从而重定向代谢通量生产血根碱。经过全面的优化，整合了 42 个表达盒的基因组，破坏了 8 个内源基因，然后利用该菌株进行补料分批发酵，发酵 125.5 小时之后，血根碱的滴度达到了 448.64 mg/L。此外，论文中提到，与摇瓶发酵不同，大多数中间体在发酵液中并未积累到高水平，这表明血根碱生物合成的效率很高。

接下来，研究团队通过向高产血根碱细胞工厂补充卤代酪氨酸，包括 3-F-酪氨酸、3-Cl-酪氨酸和 3-I-酪氨酸，成功合成了多种卤代苄基异喹啉衍生物，合成的生物催化步骤超过 15 步。这些研究结果表明，以 0.5 mM 3-F-酪氨酸为底物能够产生中间体单氟化衍生物，包括氟化血根碱。氟化血碱的生物合成突出了酵母作为构建各种苯基异喹啉生物碱通用平台的潜力。

值得一提的是，大多数卤代衍生物都不是天然存在的，这凸显了合成生物学对天然产物多样化和药物开发的变革性影响。

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