结直肠癌分子分型的表观遗传基础

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结直肠癌是一种具有高度异质性的肿瘤，其在基因组突变、DNA甲基化、基因表达以及肿瘤微环境等方面都具有特征明显的分子亚型[1]。共识分子分型（consensus molecular subtype，CMS）系统是描述结直肠癌分子特征最常用的分类方法，依据肿瘤的基因表达情况可以将结直肠癌分为CMS1、CMS2、CMS3和CMS4四种不同的分子亚型，分别具有免疫浸润、经典WNT和MYC通路激活、代谢失调以及间充质纤维化的特征[2]。进一步对结直肠癌肿瘤上皮细胞的单细胞转录组分析建立了单细胞水平共识分子分型（intrinsic consensus molecular subtypes，iCMS）系统，将结直肠癌细胞划分为iCMS2和iCMS3两个亚型[3]。其中iCMS2肿瘤细胞对应CMS2结直肠癌，而iCMS3肿瘤细胞可以进一步分为微卫星不稳定（microsatellite unstable，MSI）和微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）两类，分别对应CMS1与CMS3结直肠癌，而原有的CMS4型肿瘤被分为伴间质细胞浸润的iCMS2和iCMS3。(i)CMS分子分型系统地描述了结直肠癌肿瘤间的异质性，涵盖了驱动基因突变、基因表达、肿瘤微环境以及临床特征等多种肿瘤生物学特征。然而，目前对结直肠癌表观遗传异质性的相关研究较少，不同分子分型肿瘤的表观遗传特征以及亚型特异性基因表达的表观遗传调控机制仍不明确，这是当前该领域亟待解决的问题。

2024年3月6日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬课题组与北京大学第三医院普通外科/肿瘤中心周鑫课题组合作，在国际知名学术期刊Cancer Discovery上发表了题为Single-cell chromatin accessibility analysis reveals the epigenetic basis and signature transcription factors for the molecular subtypes of colorectal cancers的研究论文。该研究系统地揭示了结直肠癌分子分型的表观遗传基础，为深入理解结直肠癌发生发展过程中的基因表达调控机制、发现潜在的筛查和治疗靶点提供了重要线索。

该研究对结直肠癌手术切除标本中的癌旁正常组织、良性腺瘤组织以及肿瘤组织进行了高精度单细胞染色质可及性测序（scATAC-seq）分析，共收集了来自29位患者的80例样本，覆盖盲肠至直肠各个肠段。通过对结直肠癌上皮细胞的染色质可及性景观进行分析，该研究有以下5个主要发现：

图1. 结直肠癌上皮细胞的单细胞染色质可及性景观

1. 该研究发现从正常结直肠上皮向良性腺瘤的转变过程中，基因组中数万个调控元件上的DNA甲基化以及对应的染色质可及性发生了改变，这些表观遗传状态的异常改变大多数在后续良性腺瘤进一步恶变为腺癌的过程中被稳定继承。

大多数结直肠癌都由良性腺瘤发展而来[4]。该研究发现早期正常肠上皮细胞转变为良性腺瘤过程中，数万个基因组顺式作用元件（cis-regulatory elements）上发生了染色质可及性的改变，且这些腺瘤中新获得的异常染色质状态大多数在结直肠癌中得以保留。值得注意的是，良性腺瘤中被关闭的染色质峰（peak）在CpG岛中存在显著富集，这提示染色质可及性可能与DNA甲基化存在协同作用。通过对公共DNA甲基化芯片数据的深入分析，该研究证实了腺瘤中异常关闭的染色质峰伴随着DNA甲基化水平的异常升高，而异常开放的染色质峰则伴随着异常的DNA去甲基化。这一表观遗传协同调控过程改变了多个结直肠癌关键驱动基因与抑癌基因的状态。这些结果提示在良性腺瘤形成过程中，染色质可及性与DNA甲基化修饰发生紧密联系的反方向变化，二者共同调控了结直肠癌关键驱动基因与抑癌基因的表达变化。

图2. 良性腺瘤产生过程中染色质状态的动态变化

2. 该研究鉴定了决定结直肠癌重要分子分型（iCMS分型）系统的关键转录因子活性特征，发现同一亚型内仅有约10%异常激活的靶基因被不同患者共享，约90%异常激活的靶基因为不同患者特有，精准地揭示了同一亚型内不同患者肿瘤细胞共性以及个性RNA表达特征的表观遗传基础。

为了探索结直肠癌的表观遗传异质性，该研究对所有结直肠癌肿瘤细胞进行了无监督的分子分型分析，成功地鉴定出两个具有不同染色质特征的肿瘤细胞亚型。这两个亚型的染色体拷贝数变异、临床性状、基因表达等特征均与基于单细胞转录组数据鉴定到的iCMS分型高度吻合，证实了iCMS分型系统在表观基因组层面的对应性和稳健性。该研究还鉴定了iCMS2和iCMS3亚型各自特异性激活的基因组顺式作用元件与关键转录因子（transcription factor），并发现在iCMS2亚型的肿瘤中，转录因子HNF4A和PPARA特异性激活，而在iCMS3亚型的肿瘤中，FOXA3和MAFK则呈现特异性激活。更进一步，通过鉴定转录因子下游的靶基因，该研究发现虽然这些iCMS特异性转录因子在同一亚型内的所有肿瘤中都被共同异常激活，但其调控的下游靶基因却表现出高度的个体特异性。仅有大约10%异常激活的靶基因为不同个体所共有，而大约90%异常激活的靶基因为不同个体所特有。这些结果表明，亚型特异性转录因子的异常激活是区分不同iCMS亚型的重要特征。同时，尽管同一分子分型内部的肿瘤共同异常激活相同的转录因子，但其调控的下游基因集合具有强烈的个体间差异，转录因子的异常激活同时塑造了分子亚型间以及亚型内部的肿瘤异质性。

图3. iCMS亚型特异的顺式作用元件与转录因子

3. 该研究通过对肿瘤内部亚克隆的系统分析，揭示了在肿瘤演化过程中肿瘤细胞如何逐渐获得典型分子亚型特征的演进机制。

除了肿瘤间异质性外，该研究还对肿瘤内的表观遗传异质性进行了系统分析。在7位结直肠癌患者中都鉴定到了具有不同染色体拷贝数变异（copy number variation）的肿瘤内亚克隆，不同亚克隆具有不同的全基因组染色质可及性景观。对iCMS2亚型的P26患者进行的深入分析发现，位于肿瘤演化树下游的亚克隆具有更高的iCMS2特异性转录因子（如HNF4A和PPARA）活性。与之对应的，这些亚克隆也表现出更高的iCMS2模块基因表达。这些结果揭示了在肿瘤演化过程中肿瘤细胞逐渐获得典型分子亚型特征的演进机制。

图4. 肿瘤内异质性的表观遗传调控

4. 该研究鉴定了决定结直肠癌另一种重要分子分型（CIMP分型）系统的关键转录因子活性特征，发现恶性度更高的CIMP-Low与CIMP-Negative亚型肿瘤细胞中染色质状态的异常程度远高于恶性度较低的CIMP-High亚型。

部分结直肠癌具有启动子CpG岛异常高甲基化的特征，这种现象被称作CpG岛甲基化表型（CpG-island methylator phenotype，CIMP）[5,6]。在单细胞染色质可及性图谱中，该研究对不同CIMP亚型进行了鉴定，并进一步确定了决定不同CIMP亚型的顺式作用元件与转录因子。相比于恶性度较高的CIMP-Low与CIMP-Negative亚型，CIMP-High亚型中染色质状态的异常程度较低。转录因子LEF1和TCF3在CIMP-High亚型中表现出更高的活性，而KLF家族转录因子的motif则在CIMP-High关闭的染色质区域中显著富集，这可能与CIMP-High结直肠癌中基因启动子区域甲基化大规模异常增加以及相应的基因被沉默有关。

图5. CIMP亚型的鉴定与表观遗传调控

5. 该研究鉴定了与结直肠癌多维度肿瘤异质性密切相关的转录因子模块及其下游靶基因集合，发现不同核心转录因子通过协同作用共同促进了结直肠癌的肿瘤发生。

最后，该研究使用加权相关性网络（weighted correlation network）对结直肠癌图谱中的转录因子活性进行了分析，鉴定到了13个活性高度相关的转录因子模块（TF modules）。其中多个模块分别与肿瘤的iCMS分型、CIMP分型、微卫星不稳定性、原发肿瘤部位等特征显著相关。通过对模块内网络结构的进一步分析，该研究鉴定了与多维度肿瘤异质性密切相关的关键转录因子。此外，通过对转录因子模块活性与基因表达水平进行关联性分析，该研究还鉴定了关键转录因子模块的潜在下游基因。这些结果为多个转录因子如何协同作用共同调控基因表达，进而影响结直肠癌的肿瘤发生和分子表型提供了表观遗传基础。

图6. 与多维度肿瘤异质性相关的转录因子模块

综上所述，该研究对结直肠癌上皮细胞的染色质可及性景观进行了系统分析。首先，在正常结直肠上皮向良性腺瘤的转变过程中，基因组中数万个调控元件上的DNA甲基化以及对应的染色质可及性发生了改变，这些表观遗传状态的异常改变大多数在后续良性腺瘤进一步恶变为腺癌的过程中被稳定继承。其次，该研究鉴定了决定结直肠癌常用分子分型（iCMS分型、CIMP分型）系统的关键转录因子活性特征，发现同一iCMS亚型内仅有约10%异常激活的靶基因为不同个体共享，约90%异常激活的靶基因为不同个体特有，精准地揭示了同一iCMS亚型内不同个体共性及个性RNA表达特征的表观遗传基础。此外，该研究通过对肿瘤内部亚克隆的系统分析，揭示了在肿瘤演化过程中肿瘤细胞如何逐渐获得典型分子亚型特征的演进机制。最后，该研究鉴定了与结直肠癌多维度肿瘤异质性密切相关的转录因子模块及其下游靶基因集合，发现不同核心转录因子通过协同作用共同促进了结直肠癌的肿瘤发生过程。这些结果深入阐明了结直肠癌个体间基因表达异质性的表观遗传调控机理，为鉴定结直肠癌潜在的筛查与治疗靶点提供了重要线索。

北京大学生物医学前沿创新中心、北京大学生命科学学院博士生刘振宇、博士后胡玉琼、前沿交叉学科研究院博士后谢昊伶、生命科学学院博士陈坷璇为该论文的并列第一作者。北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬教授和北京大学第三医院普通外科/肿瘤中心周鑫副主任医师为本文的共同通讯作者。该研究项目得到了国家自然科学基金和北京市科学技术委员会的支持。

论文链接：

https://aacrjournals.org/cancerdiscovery/article-abstract/doi/10.1158/2159-8290.CD-23-1445/735072/Single-cell-chromatin-accessibility-analysis

文章来源：北京大学生物医学前沿创新中心

参考文献:

1.Dienstmann, R. et al. Consensus molecular subtypes and the evolution of precision medicine in colorectal cancer.Nat. Rev. Cancer17, 79–92 (2017). https://doi.org:10.1038/nrc.2016.126

2.Guinney, J. et al. The consensus molecular subtypes of colorectal cancer.Nat. Med.21, 1350–1356 (2015). https://doi.org:10.1038/nm.3967

3.Joanito, I. et al. Single-cell and bulk transcriptome sequencing identifies two epithelial tumor cell states and refines the consensus molecular classification of colorectal cancer.Nat. Genet.54, 963–975 (2022). https://doi.org:10.1038/s41588-022-01100-4

4.Dekker, E., Tanis, P. J., Vleugels, J. L. A., Kasi, P. M. & Wallace, M. B. Colorectal cancer.Lancet394, 1467–1480 (2019). https://doi.org:10.1016/S0140-6736(19)32319-0

5.Weisenberger, D. J. et al. CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer.Nat. Genet.38, 787–793 (2006). https://doi.org:10.1038/ng1834

6.Toyota, M. et al. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer.Proc. Natl Acad. Sci. USA96, 8681–8686 (1999). https://doi.org:10.1073/pnas.96.15.8681

来源：基因谷

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