FSHW | 大曲与窖泥不同组合模式下糟醅丰富和稀有类群的响应与组装：从微生物生态学到白酒酿造微生态

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Introduction

白酒是世界上最著名的传统酒精饮料之一，已有2000多年的历史。浓香型白酒（SFB）在中国的市场份额约为70%，其独特的工艺包括中温制曲，混蒸混烧，窖池发酵，具有窖香浓郁、回味悠长等特点。在SFB发酵过程中，糟醅（发酵底物）是完成微生物群落演替组装和各种化合物代谢的独特生态位。大曲（发酵剂）提供了多种功能物种和酶来启动这一过程，而含有各种厌氧菌的窖泥则是风味合成所必需的。然而，自然发酵使得不同批次的大曲往往会发生质量波动，而窖泥中微生物群落的进化则需要20多年。因此，基于功能菌种或菌群接种的生物强化大曲和人工窖泥的开发已成为调控糟醅微生物群和代谢组的有效策略之一。优质SFB的生产依赖于大曲、窖泥及其相互作用，应考虑大曲与窖泥的属性和组合，以获得更好的性能。

与自然生态系统类似，酿酒微生态系统中的微生物群是倾斜的，很少有丰富的分类群与大量的稀有分类群共存。随着微生物生态学的发展，越来越多的证据表明，稀有类群在生态系统中扮演着遗传多样性和功能多样性的“种子库”的角色。例如，稀有类群不仅作为关键物种与土壤生态系统多功能性的恢复有关，而且由于其在介导土壤氮循环中的关键作用，对作物产量的影响比丰富类群更大。然而，白酒发酵的研究主要集中在丰富的类群上，对稀有类群的群落相互作用和代谢功能研究较少。

物种进入群落是由确定性（选择）和随机（扩散和漂移）过程控制的。量化确定性过程和随机过程对特定生态系统群落组装的相对重要性可能有利于调节功能微生物群。多项研究证明，不同微生态系统的群落组装受不同的生态过程支配，这可能与微生物不同的生长习惯和传播能力，以及对环境变化的不同响应有关。此外，在时间和空间尺度上，环境变化在群落组合的确定性过程和随机过程之间起着调节作用。不同的大曲和/或窖泥也改变了枣皮的理化性质，如酸度、还原糖和乙醇含量。据报道，这些变异影响了枣培的群落组成过程，但没有考虑到丰富和稀有类群独特的生态过程。这可能不能有效地识别组装过程的关键驱动因素，进而调节群落和代谢。

因此，四川大学轻工科学与工程学院母雨博士、周荣清教授等采用多相检测方法研究了不同属性大曲与窖泥的组合对糟醅理化性质、挥发性代谢物及微生物群落的影响，旨在1）比较丰富和稀有类群对不同组合模式的响应，2）揭示丰富和稀有微生物群落的组装过程和主要驱动因素，3）探索稀有类群的代谢功能。

Results and Discussion

组合模式对丰富和稀有微生物类群的影响

一般来说，自然群落中微生物的分布是倾斜的，少量的丰富分类群与大量的稀有分类群共存。最近，在传统发酵食品中也有类似的观察记录，一些稀有类群被确定为核心功能微生物。在本研究中，0.94%的丰富细菌和4.17%的丰富真菌分别占其总序列的96.76%和94.68%（图1A），导致稀有类群的α-多样性显著高于丰富类群（图2A-B），这与几个自然生态系统一致。丰富和稀有类群的群落结构主要由乳酸杆菌（Lactobacillus）、醋酸杆菌（Acetobacter）、热放线菌（Thermoactinomyces）、芽孢杆菌（Bacillus）、曲霉菌（Aspergillus）、毕赤酵母（Pichia）和热子囊菌 （Thermoascus）组成（图1B-E），这些属在以往的研究中也很普遍。丰富类群和稀有类群的群落结构和多样性对不同组合模式表现出差异响应，其中稀有细菌亚群和丰富真菌亚群更敏感（图1）。先前的研究报道，微生物群落对外界干扰的反应可能取决于其环境宽度（即对环境因素变化的抵抗力）。因此，这种差异响应模式可能归因于糟醅理化特性对稀有细菌亚群和丰富真菌亚群落的影响更大（图2）。

组合模式对丰富和稀有类群群落组装的影响

丰富和稀有细菌亚群的组装模式存在显著差异，前者以随机过程为主，后者以确定性过程为主（图3A），这可能是由于它们对外界干扰的不同反应和生态位宽度的差异。一般来说，稀有类群的环境生态位非常狭窄，对环境变化的抵抗力较弱，而丰富类群的生态位较宽，对环境扰动的适应能力较强。稀有细菌的βNTI值与理化性质之间存在更显著的相关性也证实了这一点（图4）。虽然在白酒发酵过程中，pH和RS在调节细菌群落组装方面具有重要作用，但本研究结果强调，pH对稀有细菌群落组装的影响更大，而RS对丰富细菌群落组装的影响更大。与细菌群落相比，发现丰富和稀有真菌亚群的组装模式是相似的，主要受随机过程的驱动（图3A）。真菌群落的随机组装符合预期，因为在SFB发酵过程中，糟醅特性的变化对真菌群落演代的影响较弱。然而，酿酒酵母在小曲白酒发酵过程中的绝对优势导致真菌群落组装受控于均匀扩散，这与目前的结果不同。这种差异可能与两种白酒的工艺特点和微生物组成有关。SFB的发酵周期（60～90 d）远长于小曲酒的（7～15 d），长期的环境胁迫（如无氧、高酸度和乙醇）使发酵后期的真菌生物量急剧减少，耐酸和乙醇的酿酒酵母也在发酵后期消失。因此，本研究中的真菌群落组装主要受一个与物种随机出生和死亡相关的未知过程的支配。此外，观察到稀有真菌的βNTI值与理化性质的变化之间有更多的关联（图4），这进一步支持了稀有类群具有狭窄的环境生态位。

稀有类群在群落互作和风味形成中起着关键作用

双向PERMANOVA检验显示，大曲、窖泥及其相互作用是造成上述糟醅风味轮廓变化的主要原因，其中已酸、丁酸、己酸乙酯、乳酸乙酯等18种化合物的含量随组合模式而变化（图6A-B）。这些化合物已被鉴定为SFB的芳香活性化合物，支持了优质大曲和PM可以改善枣培风味特征和白酒感官评分的观点。挥发性化合物一般是在多种植物的协同作用下合成的，因此群落间的相互作用会影响糟醅的风味特征。此外，最近的一项研究强调，糟醅的风味质量也与共现网络的拓扑性质密切相关。本研究中，SD + FPM和FD + CPM处理显著增强了共现网络的种间相互作用（图5）。

此外，所有共现网络均以稀有类群为主，稀有-稀有和稀有-丰富连接的比例明显大于丰富-丰富连接（图5）。考虑到稀有细菌亚群落对风味谱变化的显著贡献（图6），利用PICRUSt2预测不同亚群落的功能多样性。研究发现稀有细菌亚群落的功能多样性最高，特别是与合成丁酸和己酸相关的几种关键酶仅在其中检测到（图7）。更重要的是，随机森林模型的结果表明，其α-多样性是预测糟醅中丁酸和己酸含量最显著的变量。最近的一项研究也证明了稀有细菌是发酵微生态系统的关键类群，稀有物种（Komagataeibacter europaeus）的生物增强提高了群落稳定性和风味品质。这些结果凸显了稀有类群在维持生态功能、促进群落相互作用和促进代谢活动方面的重要性。

Conclusion

结果表明，丰富类群和稀有类群的组成和多样性对大曲和窖泥组合模式表现出独特的响应，其中稀有细菌和丰富真菌亚群更为敏感。丰富和稀有细菌亚群落的组装分别受随机过程和均质选择的支配，而真菌的群落组装则受随机过程支配，受理化性质变化的影响较小。此外，SD + FPM和FD + CPM处理显著改善了共现网络和风味特征，稀有细菌在维持群落种间相互作用和代谢功能方面发挥了主导作用，尤其是己酸和丁酸的合成。本研究为调控白酒发酵提供了新的思路，提高了我们对稀有类群在酿酒微生态系统中的关键作用的认识。

一

母雨，男，四川大学轻工科学与工程学院博士研究生，主要研究方向为：基于生物扰动策略的发酵微生态体系的过程监测及定向调控；基于多组学联用技术的传统发酵食品的生产过程控制与优化；基于生态学理论的发酵食品微生态体系中的群落组装及应用。近5年参与国家自然科学基金、十三五重点研发计划等多项国家级、省部级项目，以第一作者在国内外期刊公开发表学术论文10余篇，其中SCI收录6 篇。

周荣清，工学博士，四川大学轻工科学与工程学院二级教授，博士生导师，四川省学术与技术带头人。1982年毕业于华南工学院后，至2001年在四川省食品发酵工业研究设计院从事科研开发工作，曾任总工程师等职。2001年华南理工大学获博士学位。2003年11月四川大学轻工技术与工程博士后流动站出站后，入职于四川大学。中国微生物学会工业微生物专业委员会委员，四川省食品科学学会理事，国家注册咨询工程师（投资）等。近年先后主持或参与完成了国家自然科学基金、863等科研项目5 项，主持完成了省部级科研项目项5 项，工程设计与工程询项目10 项。已发表论文100余篇，其中Sci收录40余篇，申请发明专利9 项，获授权2 项，获授权实用新型专利2 项。先后获中国轻工业联合会科技进步一等奖、四川科技进步一等奖，二等奖各1 项。

Response and assembly of abundant and rare taxa in Zaopei under different combination patterns of Daqu and pit mud: from microbial ecology to Baijiu brewing microecosystem

Yu Mua, Jun Huanga, Rongqing Zhoua,b,*, Suyi Zhangb,c, Hui Qinb,c, Hanlan Tangb,c, Qianglin Pana, Huifang Tanga

a College of Biomass Science and Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, China

b National Engineering Research Center of Solid-State Manufacturing, Luzhou 646000, China

c Luzhou Laojiao Co., Ltd., Luzhou 646699, China

*Corresponding author.

Abstract

The quality and aroma of strong-flavor Baijiu are mainly dependent on Daqu, pit mud (PM), and the interaction of both. However, little is known about how their combination patterns affect the microbiome and metabolome of Zaopei, especially the metabolic function of rare taxa. Here, an experiment on industrial size was designed to assess the effects of 6 combinations (3 kinds of Daqu × 2 kinds of PM) on the composition and assembly of different taxa, as well as the flavor profile. The results showed that Zaopei’s microbiota was composed of a few abundant taxa and enormous rare taxa, and rare bacterial and abundant fungal subcommunities were significantly affected by combination patterns. The assembly processes of abundant/rare taxa and bacterial/fungal communities were distinct, and environmental changes mediated the balance between stochastic and deterministic processes in rare bacteria assembly. Furthermore, specific combination patterns improved the flavor quality of Zaopei by enhancing the interspecies interaction, which was closely related to rare taxa, especially rare bacteria. These findings highlighted that rare bacteria might be the keystone in involving community interaction and maintaining metabolic function, which provided a scientific foundation for better understanding and regulating the brewing microbiota from the viewpoint of microbial ecology.

Reference:

MU Y, HUANG J, ZHOU R Q, et al. Response and assembly of abundant and rare taxa in Zaopei under different combination patterns of Daqu and pit mud: from microbial ecology to Baijiu brewing microecosystem[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(3): 1439-1452. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250121.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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