斑马鱼行为篇㊱：斑马鱼睡眠剥夺模型

目前针对睡眠机制的研究主要依靠动物进行，斑马鱼相比于啮齿类动物具有与人类基因同源性高、与人类慢波睡眠和快速眼动睡眠相似的优势，目前越来越多地应用于睡眠领域研究。睡眠剥夺（SD）是一种造成动物失眠的有效方式，咖啡因是制造动物失眠模型的常用药物之一，通过结合大脑神经中的腺苷受体抑制睡眠，增强觉醒。相关研究发现，咖啡因处理后的斑马鱼幼体，出现运动状态持续时间及大运动覆盖距离增加，静息状态持续时间及覆盖距离减少，与失眠的临床特征相似。

选取5dpf野生型AB系斑马鱼，在显微镜下挑选发育正常的斑马鱼，随机分为6组，分别为正常组、模型组、给药组。

斑马鱼行为交流群

造模与干预

药物的最大耐受浓度（MTC）：药物的MTC是药物不引起实验动物死亡的最大剂量。随机选取140条5dpf斑马鱼置于6孔板中，按不同的浓度各分为7组，每组20只。将干预药物（例：益神宁心方）的浓度初步设定为25、50、100、250、500、1000和2000mg/L，每孔加入3mL，持续暴露24h，观察斑马鱼的反应情况，并统计各实验组的死亡数量与死亡率。根据初步浓度结果进一步细化后再次进行实验，最后统计所得结果计算浓度效应，最后确定中药的MTC。最佳咖啡因造模剂量　应用200、250、300、350及400μmol/L5组不同浓度咖啡因作用斑马鱼1h后，定量分析其行为学改变1h，检测5组斑马鱼运动距离、运动时间、静息时间及大、中、小运动时间。每组12条。

造模及干预方法：正常组：正常饲养，未处理；模型组：应用咖啡因水溶给药处理斑马鱼24h；益神宁心方各组：选取中药MTC、1/3MTC和1/9MTC分别设为益神宁心方高剂量组、中剂量组和低剂量组，在模型组基础上，用中药水溶给药处理斑马鱼24h；褪黑素组：确定10μmol/L褪黑素为最低有效剂量，在模型组基础上，用此浓度褪黑素水溶给药处理斑马鱼24h。

检测指标与方法

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检测自主活动

使用FishTrack软件记录并评估斑马鱼的运动行为，设置速度20mm/s为大运动。在对5dpf斑马鱼持续24h给药过程中，对各组给药后5h斑马鱼幼鱼进行黑暗状态下连续1h（3600s）的自发行为记录，记录各组斑马鱼的运动时间、运动距离、静息时间和3种运动形式的运动时间。每组12条。

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检测趋触性

趋触性是指斑马鱼在一个新的环境中，是否会自发接近容器边缘地带的特性，反映斑马鱼焦虑水平。1h行为学检测结束后，将各组斑马鱼幼鱼转移至24孔板中，每孔中一条幼鱼、2mL溶液，孔的内径为15.88mm，幼鱼可自由活动。将24孔板每孔分为中心区和外周区两个观察区，中心区面积为整孔面积的一半。斑马鱼幼鱼首先在行为观察仪系统中适应5min的黑暗环境，然后在15min明暗交替（黑暗5min、光照5min、黑暗5min交替）的条件下进行实验，连续测定斑马鱼的趋触性行为15min。统计斑马鱼在两个区域游动的距离和时间，其中以中心区域累积运动占全区域的距离百分比及时间百分比为指标表征斑马鱼的趋触性。

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行为分析

5dpf斑马鱼进行1h不同浓度咖啡因浸泡后，对斑马鱼幼鱼运动行为进行连续1h（3600s）的自发行为记录。与正常组比较，300μmol/L咖啡因组斑马鱼运动距离、运动时间显著增加，静息时间显著减少。与正常组比较，模型组斑马鱼黑暗状态下运动状态覆盖距离及持续时间均显著增加，中运动时间显著增加，静息状态覆盖时间显著减少。与正常组比较，模型组中心区域时间百分比和中心区域距离百分比显著减少，模型组斑马鱼趋触性行为增加。趋触行为可反映斑马鱼的焦虑行为，光照-黑暗交替的视觉反应测试可以引起斑马鱼幼鱼的超运动行为，在光照-黑暗转变期间斑马鱼幼鱼趋触性行为增加，反映出这种外来的环境刺激增加了斑马鱼幼鱼的焦虑水平。同时，咖啡因可诱发斑马鱼的焦虑样反应，并和剂量、集体环境相关。明暗刺激下咖啡因模型组中心区域时间百分比和中心区域距离百分比减少，提示斑马鱼趋触性行为增加，符合斑马鱼焦虑行为的特征。

参考文献：

1、张瑞,张振贤,史佳宁,等.益神宁心方对斑马鱼睡眠剥夺模型行为学及神经递质的影响[J].上海中医药杂志,2024,58(01):89-95.

2、咖啡因与光照诱导斑马鱼睡眠剥夺模型行为学研究[J]. 冉思邈;谭爱华;石和元;王平.海南医学院学报,2021(22)

3、Melatonin administration attenuates acute stress by inducing sleep state in zebrafish (Danio rerio)[J]. Lunkes Luciana Crepaldi;Paiva Isadora Marques;Egger Renata Catão;Braga Weslley Fernandes;Alvarez Leite Jacqueline Isaura;da Cunha Barreto Vianna André Rodrigues;Murgas Luis David Solis.Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology,2021

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