2区TOP刊-广中医一附院揭示网药与蛋白质组揭示小青龙汤对中性粒细胞性哮喘的保护作用

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

小青龙汤（XQLD）是临床上常用的中草药配方，尤其适用于哮喘等过敏性疾病。然而，其治疗中性粒细胞性哮喘（NA）的内在机制尚不清楚。本研究旨在利用网络药理学和体内实验评估XQLD对NA的疗效和潜在机制。首先，通过网络药理学初步阐明了XQLD改善NA的活性化合物、潜在靶点和机制。然后，用XQLD处理卵清蛋白/完全弗氏佐剂(OVA/CFA)诱导的NA小鼠以评估其疗效。然后使用差异表达蛋白（DEPs）的串联质谱标签方法对蛋白质进行分析和定量，以进一步揭示XQLD处理NA的机制。最后，对枢纽基因、关键DEP和潜在途径进行了验证。在XQLD中鉴定出176个活性化合物和180个抗NA靶标。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示CXCL10、CX3CR1、TLR7、NCF1和FABP4为枢纽基因。体内实验表明，XQLD减轻了NA小鼠肺部的炎症浸润、气道粘液分泌和重塑。此外，XQLD通过降低IL-8、MPO和NE的表达，显著减轻了NA小鼠的气道中性粒细胞炎症。XQLD还降低了与中性粒细胞炎密切相关的CXCL10、CX3CR1、TLR7、NCF1和FABP4的水平。蛋白质组学分析在对照组、NA组和XQLD组中确定了28个重叠的DEPs，我们发现XQLD抑制铁死亡信号通路（GPX4升高和ASCL3降低）以及ARG1、MMP12和SPP1的表达，同时激活Rap1信号通路。这项研究表明，抑制ARG1、MMP12和SPP1的表达以及铁死亡途径和激活Rap1信号通路有助于XQLD对NA的治疗作用。

图文摘要

论文ID

原名：Integrative analysis of network pharmacology and proteomics reveal the protective effect of Xiaoqinglong Decotion on neutrophilic asthma

译名：网络药理学与蛋白质组学的综合分析揭示了小青龙汤对中性粒细胞性哮喘的保护作用

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2024.3

通讯作者：黄秀芳、李得堂、詹少锋

通讯作者单位：广州中医药大学第一附属医院

实验设计

主要内容

1.药物-化合物-靶点（D-C-T）和PPI网络

基于TCMSP数据库和相关文献，最终获得了176种XQLD的主要活性成分（补充表2）。在排除重复后，共筛选了1608个活性成分的潜在靶点（补充表3）。我们还在GEO中获得了1939个NA的DEG（补充表4）。通过将XQLD活性成分的交叉靶点映射到NA的疾病靶点，获得了180个交叉靶点（图1A，补充表5）。

图1 小青龙汤对NA的网络药理学结果。（A）XQLD靶基因与NA靶基因交叉的维恩图。（B） C-T-D网络：圆形节点表示XQLD的成分，菱形节点表示药物的活性成分，红色菱形表示药物的常见成分，蓝色方形节点表示潜在的靶基因。（C）180个交叉靶基因的PPI网络，以及程度≥16的枢纽基因。（D–F）GO富集分析：前10名分别为BP、MF和CC。（G）十大KEGG途径。

我们通过Cytoscape软件构建并分析了D-C-T网络（图1B）。然后构建PPI网络，并根据度值≧ 16筛选关键基因 （图1C–补充表6）。从DAVID数据库中总共获得了45个显著富集的GO条目，包括24个BP，8个 MFs和13 CC（补充表7）。BPs主要参与炎症反应、磷脂酶C激活的G蛋白偶联受体信号通路、凋亡过程的负调控和细胞对脂多糖的反应。CC主要富集于细胞外泌体、胞质溶胶、质膜和膜筏。MFs主要与蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、ATP结合、蛋白激酶活性和C–C趋化因子结合有关。此外，共富集了73个途径（补充表8），其中富集程度最高的途径包括趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路（图1D-G）。

2.XQLD的HPLC检测

取供试品溶液，得到具有19个主要特征峰的XQLD的HPLC，并根据液相色谱条件进行检测，结果如图2所示。

图2 小青龙汤的高效液相色谱图峰信息：1:芍药苷，2:甘草酸，3:6-姜酚，4:五味子甲，5:细辛。

3. XQLD改善NA小鼠的一般行为

对照组小鼠皮毛光泽洁白，呼吸稳定，进食正常。虽然模型组小鼠在致敏和激发阶段表现出毛发竖立、易怒、抓鼻、呼吸加深和加速等症状，而地塞米松组的小鼠表现出与NA小鼠相似的症状。与模型组相比，XQLD处理组的小鼠皮毛更光滑，呼吸更顺畅，抓鼻更少。

4. XQLD改善NA小鼠气道炎症、粘液分泌和重塑

为了研究XQLD对NA气道炎症、粘液分泌和气道重塑的影响，我们通过HE、PAS和Masson染色分析了肺组织的病理变化。与对照组相比，NA小鼠在支气管周围和血管周围结缔组织中有大量炎症细胞浸润。此外，NA小鼠的气道粘膜上皮结构受损和紊乱，伴有局灶性呼气，杯状细胞增生和粘液。同时，NA组的气道和血管平滑肌增殖更为明显。与NA组相比，不同剂量的XQLD显著减轻炎症浸润和气道重塑（P＜0.05）。其中，只有高剂量XQLD能减轻气道粘液分泌（P＜0.05）。然而，地塞米松并没有改善上述病理（P＞0.05）（图3B–D，3G-I）。

我们通过HE染色评估肝脏和肾脏组织的组织形态学来确定XQLD是否有毒。病理结果显示，各组小鼠肝肾组织均无明显炎症损伤或病理表现（P＞0.05）（图3E-F，3J-K）。

图3 中性粒细胞哮喘（NA）小鼠模型的构建和肺、肝、肾组织的组织学分析。（A）NA小鼠模型的实验方案；（B）肺组织的苏木精和伊红（HE）染色；（C）肺组织的PAS染色；（D）肺组织的Masson三色染色；（E-F）肝和肾组织的HE染色；（G）肺组织的HE染色的定量；（H）肺组织PAS染色的定量；（I）Ashcroft得分；（J）Suzuki得分；（K）管状损伤评分。比例尺100  μm。数据以平均值 ± SEM表示，ns:p>0.05；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p < 0.0001。

5.XQLD抑制中性粒细胞浸润和中性粒细胞炎症相关细胞因子和IgE表达

如图4所示，NA小鼠的肺部炎症主要由中性粒细胞浸润引起。XQLD处理后，我们观察到中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和白细胞总数显著减少。众所周知，IgE在过敏性疾病中起着至关重要的作用，暴露于OVA/CFA后，血清IgE水平升高（图4G）。此外，与中性粒细胞炎症密切相关的炎性细胞因子，如IL-8和MPO，在NA组的血清或BALF中也增加（图4H–J）。XQLD可不同程度降低上述炎性细胞因子（IgE、IL-8和MPO）（P＜0.05）。然而，地塞米松对缓解上述炎性细胞因子的增加无效（P＞0.05）（图4G–J）。NA小鼠肺组织中的免疫荧光染色显示NE和MPO的分布增加，而XQLD降低了这两种关键的中性粒细胞衍生蛋白的表达水平（图5A-B）。

图4 小青龙汤抑制小鼠中性粒细胞哮喘模型中的中性粒细胞炎症。（A）支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞切片。黄色箭头：淋巴细胞；绿色箭头：中性粒细胞；蓝色箭头：嗜酸性粒细胞；黑色箭头：巨噬细胞( × 400)；（B–F）BALF中四种不同的细胞计数；（G-I）血清中IgE、IL-8和MPO的表达；（J）MPO在BALF中的表达水平。N = 4。ns:p>0.05；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p < 0.0001。

图5 小青龙汤可抑制关键靶点 NE和MPO的表达。NE和MPO的（A–B）免疫荧光染色( × 400)。（C–G）网络药理学证实的与中性粒细胞炎症相关的CXCL10、CX3CR1、TLR7、FABP4和NCF1的mRNA表达。N = 3。ns:p>0.05；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p< 0.0001。

6.XQLD降低PPI网络中鉴定的中枢基因的表达

基于网络药理学的结果，我们通过PPI分析获得了几个关键基因。在体内实验中，我们检测了CXCL10、CX3CR1、TLR7、NCF1和FABP4的mRNA表达，它们在中性粒细胞性气道炎症中发挥着重要作用。正如我们所预期的，与NA组相比，不同剂量的XQLD抑制了上述基因的mRNA表达（P＜0.05）。同样，地塞米松对CXCL10、CX3CR1和TLR7无效（P＞0.05）（图5C–G）。地塞米松可抑制FABP4和NCF1的表达。

7. 蛋白质组学分析揭示XQLD治疗NA的机制

对照组、模型组和XQLD组之间的DEP使用|foldchange|≥1.2和p值<0.05的筛选标准进行鉴定。模型组和对照组、XQLD组和模型组以及XQLD和对照组之间的DEP如图6A–C中的热图和图6D–F中的火山图所示。图6G显示，与对照组相比，模型组有638个上调的DEPs和440个下调的DEPs，XQLD组有737个上调的DEPs和491个下调的DEPs。此外，与模型组相比，XQLD组有23个上调的DEP和72个下调的DEPs，三组有28个DEPs（补充表9）。

图6 蛋白质组学分析。（A–C）：热图分别显示了模型组与对照组、模型组与XQLD-M组、对照组与XQL D-M组的DEP。（D–F）：火山图分别显示了模型组与对照组、模型组与XQLD-M组、对照组与XQL D-M组的DEPs。横轴表示log2（FC），离零更远的值表示差异更大。图的右侧表示上调，而左侧表示下调。纵轴表示-log10（P值），离零更远的值表示更大的意义。蓝点表示下调的DEP，红点表示上调的DEP，灰点表示不显著的DEP。（G）条形图分别显示了模型组与对照组、模型组与XQLD-M组、对照组与XQLD-M组的上调和下调DEP的数量。（H）Venn图显示了模型组与对照组、模型组与XQLD-M组、对照组与XQL D-M组的独特且重叠的DEP。

我们重点研究了模型组和对照组、XQLD组和模型组之间的DEP，然后进行了富集分析。GO分析（图7A）显示，与对照组相比，在模型组中，细胞质翻译是最显著的BP，胞质核糖体是最明显的CC，核糖体的结构成分是最显著的MF。同时，与模型组相比，XQLD组的心肌收缩是最显著的BP，心肌收缩、肌钙蛋白复合物和通道蛋白活性分别是最明显的CC和MF（图7B）。

图7 GO和KEGG富集分析。（A）模型组和对照组之间DEP的GO分析。（B）XQLD-M组和模型组之间DEP的GO分析。（C，F）模型组和对照组之间DEP的富集分析。（D，G）XQLD-M组和模型组之间DEP的富集分析。分别分析上调和下调的DEP。在GO分析中，分析了生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。在KEGG富集分析中，根据P值计算显著途径。

KEGG富集分析显示，模型组和对照组中上调的DEP在“吞噬体”、“溶酶体”、“铁死亡”、“核糖体”和“内质网中的蛋白质加工”途径中显著富集（图7F）。同时，下调的DEP主要富集在“紧密连接”、“肌动蛋白细胞骨架的调节”、“局灶性粘附”、“粘附连接”和“Rap1信号通路”中（图7C）。此外，模型组和XQLD组之间上调的DEP主要富集在“NF-κB信号通路”中（图7G），而下调的DEP在“铁死亡”途径中显著富集（图7D）。

8. 抑制铁死亡途径、ARG1、MMP12和SPP1以及激活RAP1途径有助于XQLD在NA中的疗效

基于蛋白质组学结果，我们重点研究了可能在XQLD治疗NA中发挥重要作用的铁死亡和核心基因，并通过IHC评估了它们的表达。如图8所示，与对照组相比，NA小鼠表现出ACSL3表达增加和GPX4表达减少，而XQLD显著降低了肺组织中ACSL3的蛋白质水平并增强了GPX4的水平。ARG1、MMP12、SPP1是NA小鼠表达水平升高的关键基因，XQLD抑制了它们的蛋白质表达。此外，我们发现RAP1信号通路也可能有助于XQLD治疗NA。IHC结果表明，与对照组相比，模型组的RAP1表达降低，而XQLD处理后RAP1表达增加。总之，上述结果表明，XQLD通过抑制铁死亡途径和ARG1、MMP12和SPP1的表达，并激活RAP1信号通路，来改善NA。

图8 核心基因的抑制以及铁死亡途径和激活RAP1途径有助于XQLD对NA的治疗作用。（A–D）免疫组织化学图像和核心基因（ARG1、MMP12和SPP1）的H得分；（E、G和H）免疫组织化学图像和参与铁死亡途径的基因（GPX4和ACSL3）的H得分；（F和I）免疫组织化学图像和RAP1通路的H-得分；比例尺100 μm。数据以平均值 ± SEM表示，ns: p>0.05；*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001；****：p < 0.0001。

抗炎类固醇如糖皮质激素通常能有效抑制炎症。NA患者通常对吸入皮质类固醇不敏感，这限制了治疗方案的选择。因此，由于其显著的多途径作用，中医药越来越被认为是治疗NA的一种策略。XQLD还以多组分、多靶点、多途径的优势广泛应用于治疗哮喘、COPD和咳嗽。我们的研究发现，XQLD通过抑制ARG1、MMP12和SPP1的表达以及铁死亡途径和激活RAP1途径，减轻了中性粒细胞气道炎症、气道粘液分泌和重塑。

我们的研究表明，槲皮素、6-姜酚、木犀草素、异鼠李素、肉桂醛、甘草异黄酮是XQLD治疗NA的关键活性成分。槲皮素尤其具有多种抗炎、抗病毒和抗色素沉着的作用。一项在NA小鼠模型中的研究表明，槲皮素可能通过减少中性粒细胞气道炎症发挥保护作用。6-姜酚在抑制细胞活力、迁移和侵袭方面的功效已得到证实。研究表明木犀草素和肉桂醛具有强大的抗炎作用。异鼠李素减少肺组织中中性粒细胞的浸润，抑制MPO的表达，降低TNF-α和IL-Iβ的水平，从而减轻肺损伤。我们进一步确定CXCL10、CX3CR1、TLR7、NCF1和FABP4是XQLD治疗NA的关键基因。作为中性粒细胞迁移级联的一部分，化学引诱剂及其受体也参与其中，包括化学引诱剂脂质、趋化因子、补体苊毒素和甲酰基肽。富集分析显示，这些关键基因主要参与细胞对低氧水平和脂多糖的反应、中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞活化。网络药理学结果提供了初步证据，表明XQLD可以通过调节关键基因如CXCL10、CX3CR1、TLR7、NCF1和FABP4以及生物过程如氧化应激、中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞活化来治疗NA。

然后，我们构建了NA小鼠模型，发现NA小鼠的肺部炎症以中性粒细胞浸润为主，IL-8、MPO和NE水平升高，证实了NA模型的成功。中性粒细胞趋化因子和蛋白酶（如IL-8、MPO和NE）在患有中性粒细胞炎症的哮喘小鼠中升高。IL-8是一种促进中性粒细胞募集的促炎CXC趋化因子。临床和动物研究都表明，IL-8在NA中升高。中性粒细胞分泌MPO以响应各种刺激，因此MPO是中性粒细胞活化的特异性标志物。中性粒细胞浸润和疾病严重程度与气道中MPO水平升高有关。中性粒细胞的过度激活导致NE过度表达，进而诱导IL-8分泌增加。我们的研究表明，XQLD导致IL-8、MPO和NE的表达减少，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和白细胞的总数显著减少。XQLD改善了NA小鼠的气道中性粒细胞炎症、粘液分泌和重塑，证明了XQLD治疗NA的疗效。此外，CXCL10、CXCL1、TLR7、FABP4和NCF1的表达在NA小鼠中显著升高。CXCL10促进Th1细胞因子的产生，同时抑制Th2细胞因子的表达。CXCL10水平升高与疾病的严重程度有关，包括气流受限。Gauthier M等人从严重哮喘患者中发现了高水平的CXCL10，并强调了CXCL10水平升高与疾病管理不善之间的正相关性。肺中性粒细胞浸润和活化是严重哮喘的重要病理生理特征，主要由CXCL8和CXCL1促进。CXCL1在与炎症或疾病反应相关位点的表达升高导致中性粒细胞浸润。TLR7多态性与特应性和哮喘相关，TLR7的激活增加了IFN-γ和IL-12的水平。在最近的一项研究中，FABP4缺陷哮喘小鼠的气道炎症显著减少。在Ncf缺乏的小鼠中，肺泡和气道中的免疫细胞浸润减少。NCF1缺乏增强了Th1免疫反应，导致ILC2失活，从而保护小鼠免受肺部炎症的影响。所有上述基因都被XQLD处理不同程度地抑制，从而减少气道炎症、粘液分泌和NA重塑。

蛋白质组学分析以进一步研究XQLD治疗NA的机制。核心基因包括AGR1、MMP12和SPP1。MMPs是一类结构和功能相关的蛋白质水解酶，在与炎症相关的组织重塑和修复过程中发挥着关键作用。IHC分析显示，与对照组相比，哮喘患者大气道中与气道平滑肌相关的细胞外基质中MMP12水平增加。MMP12的抑制下调过敏原致敏绵羊对过敏刺激的早期和晚期气道反应。SPP1被认为是小鼠肺功能的重要调节因子和肺发育的决定因素。一项遗传学研究确定SPP1基因是波多黎各人哮喘和哮喘相关表型的危险因素。然而，其他文章未发现AGR1和NA之间的关系。因此，对这一主题的进一步研究可能是一个有趣的探索方向。我们的研究与先前的研究一致，证实核心基因在NA小鼠中升高，XQLD抑制这些基因的表达以改善NA。我们的研究表明，XQLD对NA的作用机制涉及铁死亡和RAP1途径。对照组和模型组之间上调的DEP主要富集在铁死亡途径中，模型组和XQLD组之间下调的DEP也富集在铁死亡途径中。蛋白质组学结果表明GPX4和ACSL3在铁死亡途径中显著富集。我们发现NA小鼠表现出ACSL3增加和GPX4表达减少，而XQLD降低了ACSL3水平并增加了GPX4水平。铁死亡是一种主要由严重的脂质过氧化诱导的细胞死亡的调节形式，其依赖于ROS和铁过载。铁死亡与多种肺部疾病有关，包括急性肺损伤、肺纤维化、慢性阻塞性肺病和哮喘。GPX4被认为是铁死亡的关键调节因子，铁死亡是一种保护细胞膜和防止铁死亡发生的过程。GPX4在细胞膜的复杂环境中表现出催化脂质过氧化物还原的能力。GPX4的缺失导致脂质过氧化，这突出了GPX4在保护细胞免受脂质过氧化的有害影响方面的重要作用。在哮喘恶化的情况下，氧化应激增加导致GPX4活性降低，这可能导致上皮细胞功能障碍、细胞死亡和哮喘控制下降。此外，炎性细胞因子释放的增加促进了ROS在肺部的产生和积累。ROS反过来诱导氧化损伤，并有可能引发与NA相关的各种炎症过程。类似地，ACSL3是铁死亡的另一个重要调节剂。ACSL3是ACSL基因家族的成员，负责编码参与脂肪酸代谢的关键酶。ACSL3位于2q36.1区域，与特定人群的哮喘易感性有关。预测肺组织中ACSL3的抑制会影响膜磷脂组成和炎症介质的产生。先前在人类中报道的ACSL3基因沉默与母体暴露于空气中的PAH和PAH相关哮喘有关。RAP1因其在调节细胞粘附、细胞生长、细胞凋亡、细胞骨架重塑和运动等各种生理反应中的作用而广为人知。此外，RAP1蛋白在调节炎症反应中起着至关重要的作用。在免疫系统中，RAP1通路表现出多种功能，特别是在影响白细胞功能和限制白细胞迁移方面。RAP1通路是严重哮喘期间支气管上皮细胞的主要分子机制，也可能介导呼吸爆发中的信号事件。这些发现表明，XQLD可能是通过抑制AGR1、MMP12、SPP1和铁死亡途径的表达以及激活RAP1途径来治疗NA的潜在策略。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.118102

多组学测序服务：

1.代谢组学(非靶/靶向)：300起

2.转录组测序：480起

3.蛋白质组学：1500元起

相关咨询，加微信：1278317307。

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。

中药复方266

动物脑科学26

多组学46

中药复方 · 目录

上一篇农林1区: 协和医学院中医科以靶向代谢揭示糖尿病周围神经病变的异常能量状态及中药筋脉通的神经保护机制