科学研究证实：冷冻保存20年以上的间充质干细胞，仍保持活力和功能！

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本文作者：福建医科大学 YANG

本文审核专家：江苏大学附属医院 李晶教授

引言

近年来，干细胞成为细胞治疗领域的热门领域，涉及的疾病越来越多。冷冻保存是最为常见的干细胞储存和运输方式，成为目前的黄金标准。通过冷冻技术而长期存储细胞，为后续的科学研究、疾病治疗等提供资源。那么，经过长期的冷冻后，干细胞的活力和功能会改变吗？根据发表的文献，经过20年以上冻存，仍然可以获得良好分化能力的间充质干细胞。国内也有多个文献证实，冷冻复苏后脐带/胎盘间充质干细胞生物学特性仍保持稳定。这些科学文献为冷冻存储间充质干细胞的未来应用提供了有力的证据。

近年来，深低温存储技术的发展，已经被广泛应用至干细胞保存当中，推动了干细胞存储的发展，为干细胞治疗的临床发展及应用奠定了基础。越来越多的细胞治疗在临床开发过程中采用到了冷冻保存工艺，基于冷冻保存的细胞疗法的新药临床试验申请也相继获得批准。

随着冷冻保存干细胞的逐渐流行，人们对冷冻保存后干细胞的功能也有很多的兴趣和好奇。比如，冻存20年或者30年后的干细胞，它的活性和功能还保持得跟原来一样吗？今天我们通过最新的文献来给大家回答。

文献证实：

冷冻保存20以上的间充质干细胞仍具有强大的分化潜能

一项研究[1]将已经冷冻保存23-25年的人细胞样本解冻后扩增繁殖以获得间充质干细胞，并以新鲜采集的人细胞样本作为对照，比较二者的恢复效率和生长特性以及分化潜能。

结果表明，二者间充质干细胞在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞的能力相似。证实即便经过长期（23-25年）冷冻保存，仍可以获得具有良好分化能力的间充质干细胞。

在这项研究中，研究人员评估长期冷冻保存的间充质干细胞（MSCs）的活力及分化潜能。结果发现：

（1）尽管长期冷冻保存和解冻后部分细胞被损坏，但经过培养仍然可以获得适量的贴壁健康细胞。

（2） 可以从长期冷冻保存的原代培养物中获取到间充质干细胞。

比如，在研究中，3天后冻存组和对照组均可见小棱柱贴壁细胞，培养10天后数量增多。第 14 天时，两组贴壁细胞均呈现螺旋状生长。14天后，冷冻组和对照组中成纤维细胞样细胞的百分比分别为88.2±4.3%和89.1±3.8%（p>0.05）。当根据存活细胞数量计算时，两组都具有相似的增殖能力。通过测定了MSCs常见分子标记的表达，表明上述成纤维细胞样细胞确实是MSCs。

图片来自文献[1]

（3）长期冷冻保存间充质干细胞仍具有强大分化潜能：结果表明，冻存组和对照组获得的P3培养物分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞的能力没有显着差异，表明长期冻存和解冻并未损害间充质干细胞的分化潜力。

系统综述提供高级别证据：

冷冻保存不会影响干细胞活性及功能

为了进一步验证上述实验得出的冷冻保存不会影响干细胞活性及功能的结果。另一研究团队进行了一项系统综述评价[2]，该研究发表于国际期刊《Journal of Translational Medicine》,通过纳入41 项体外研究进行综合分析，得出和上述实验一样的结论：冷冻保存不会影响间充质干细胞的形态、表面标志物表达、分化或增殖潜力。为上述结果提供了更高级别的证据。

该研究使用 PubMed、Science direct 和 Google Scholar 进行系统文献检索，最终纳入41项研究，详细了解每篇文章的冷冻溶液成分、冷冻方案、储存时间、冷冻细胞浓度、冷冻传代数以及解冻方法等信息。并提取有关细胞表面标志物表达、分化潜力、增殖和生长、附着和迁移潜力、基因组稳定性和旁分泌功能。此外，还对解冻后的活力和形态信息进行了整理。（下图为流程图）

图片来自文献[2]

最终分析结果表明[2]：冷冻保存不影响间充质干细胞的形态、表面标志物表达、分化或增殖潜力。然而，关于对集落形成能力的影响存在不同的结果，对活力、附着和迁移、基因组稳定性和旁分泌功能的影响尚未确定，这主要是由于不同研究的冷冻保存过程的巨大差异以及缺乏标准化的检测方法。因此，未来需要进行进一步的评估以及建立统一的冷冻保存体系。

小结

毫无疑问，干细胞已经成为目前疾病治疗的研究热点，其中冷冻存储技术在其中起到了重要的作用。利用冷冻存储的间充质干细胞来开发细胞疗法已经被越来越多的国内外研究团队采用。因此有关冷冻保存后干细胞的活力和功能也一直是众多学者的关注焦点。以往的研究已经表明冷冻保存的安全性及有效性，不会影响干细胞解冻后的活力和功能。

目前国内比较流行的脐带和胎盘组织间充质干细胞的冷冻存储，这类间充质干细胞长期冷冻保存以后其生物学功能仍然保持稳定，这已经被文献证实[3]。间充质干细胞的冷冻存储技术对细胞治疗发展具有重要意义，可以提高干细胞治疗的可行性和有效性，为更多患者提供创新的治疗选择。然而，干细胞冷冻保存需要全流程的高质量标准和技术保障体系，方能为临床应用提供安全保障！

参考文献：

[1] Shen JL, Huang YZ, Xu SX, Zheng PH, Yin WJ, Cen J, Gong LZ. Effectiveness of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow cryopreserved for 23-25 years. Cryobiology. 2012 Jun;64(3):167-75. doi: 10.1016/j.cryobiol.2012.01.004. Epub 2012 Jan 18. PMID: 22280954.

[2] Bahsoun S, Coopman K, Akam EC. The impact of cryopreservation on bone marrow-derived mesenchymal stem cells: a systematic review. J Transl Med. 2019 Nov 29;17(1):397. doi: 10.1186/s12967-019-02136-7. PMID: 31783866; PMCID: PMC6883667.

[3] 王友臣,柴亮,史恩祥,等.人脐带间充质干细胞冻存复苏后生物学性状研究[J].解放军医药杂志, 2011(A04):4.DOI:10.3969/j.issn.2095-140X.2011.04.001.

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