工程酵母细胞工厂生产三大类亲脂性抗氧化剂最新综述

脂溶性抗氧化剂对保护富含脂质的结构免受氧化损伤和减少慢性疾病的风险至关重要。这些抗氧化剂是均衡饮食不可缺少的组成部分，在食品、化妆品、保健品、药品和动物饲料等各个领域都有不同的应用。

传统上，亲脂性抗氧化剂的提取主要依赖于天然来源或化学合成。然而，从天然来源（如植物）中生产上述抗氧化剂往往面临产量有限、稳定性低、栽培方法复杂、提取和净化费用高昂等诸多挑战；而化学合成具有环境污染、不可持续的问题，并且在实现复杂结构所需的立体化学和区域化学方面遇到诸多困难。

近日，来自伊利诺伊大学香槟分校和爱荷华州立大学的团队，对工程酵母微生物工厂生产三大类亲脂性抗氧化剂（类胡萝卜素、维生素 E 和苯乙烯类）的最新进展做出了综合性阐述，文章讨论了用于提高前体可用性和缓解碳通量竞争的经典策略，以及酶工程、产物隔离、亚细胞区隔化、多级发酵和形态工程等多种创新方法，并强调了微生物工程在亲脂性抗氧化剂生产方面的前景。

这项研究以“Building Synthetic Yeast Factories to Produce Fat-soluble Antioxidants”为题发表在Current Opinion in Biotechnology上。

▲图 |（来源：Current Opinion in Biotechnology）

类胡萝卜素是亲脂性萜类代谢物，是色素的常用原料，包括胡萝卜素（如 α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和番茄红素）和叶黄素两种类型。类胡萝卜素不能在体内合成，饮食是生物体摄取其的唯一途径。经过在肠道内特定的酶转化，某些类胡萝卜素能够合成维生素 A，而维生素 A 对视力、细胞通讯、免疫反应、生长发育和生殖系统健康至关重要，这些益处主要归功于其抗氧化特性。

维生素 E，或称生育酚，是一组脂溶性化合物，包括四种生育酚和四种生育三烯酚（α，β，γ 和 δ 形式），其酚环上有甲基取代。这些化合物具有两亲性结构，具有一个来自均苯三酚酸（HGA）的极性色满醇头部基团和一个来自 GGPP（生育三烯醇）或植基焦磷酸的脂溶性异戊二烯基烃尾部。天然维生素 E 仅由光合生物如植物和藻类合成，主要位于叶绿体膜上并储存在基质中。

苯乙烯类化合物主要指芪类和黄酮类化合物。芪类化合物是芪的羟基化衍生物，具有 C6-C2-C6 的化学结构，其中最常见的是葡萄、浆果和花生中的白藜芦醇，由于其亲脂性的芳香环结构，通常更易溶于有机溶剂，从而具有更高的脂溶性；黄酮类化合物具有三环骨架 C6-C3-C6，由于取代和修饰的多样性而具有更多类型，由于其化学结构中含有多个羟基和其他极性官能团，通常被认为是水溶性的。

▲图 | 在酿酒酵母中脂溶性抗氧化剂的生物合成途径。(a) 维生素 A 和类胡萝卜素途径；(b) 维生素 E（生育三烯酚）途径；(c) 芪类化合物途径（来源：Current Opinion in Biotechnology）

文章首先指出，在酵母宿主中，增强类胡萝卜素和维生素 E 的产生通常集中在增加天然 MVA 途径的上游通量上，另外，维生素 E 和芪类的生物合成都依赖于莽草酸途径，该途径中的一些关键酶基因和辅助因子的可利用率是优化上游模块以提高生产的重要因素。

然而，每一类抗氧化剂在下游模块中都面临着独特的挑战。例如，酶与酶之间底物偏好匹配的不充分，表达水平和活性的不平衡，底物和产物相抑制导致中间化合物积累和途径效率的降低，亲脂性化合物的疏水性对亚细胞和细胞膜及宿主细胞生长的影响，酶的表达目的地在异源宿主内不能有效对齐等。

为应对这些挑战，目前主要有五类创新性策略。

首先是酶工程策略。这一策略主要通过结合不同来源的酶、筛选和优化酶的组合、构建代谢物通道以及使用高通量筛选和合成生物学方法来提高微生物生产非原生产物的产量。

例如，利用异源酶的组合，克服单一来源酶的限制，并减少中间体和副产物的积累；筛选不同来源的酶，并对其进行定向进化或结构引导蛋白工程改造；构建融合酶或使用合成支架或短肽（如 RIAD 和 RIDD）来组装酶复合物以优化代谢物在细胞内的流动，以减少中间产物的扩散损失并提高转化效率；在某些情况下，选择刚性连接剂（如 E3AK）替代柔性连接剂，更精确地控制酶之间的相互作用和距离；利用高通量筛选技术快速识别出具有优良性能的酶突变体；在微生物中构建复杂的代谢途径，以生产非原生产物。

第二类是亲脂性化合物的工程储存、提取和分泌策略。这一策略主要针对亲脂性化合物的疏水性对细胞膜及细胞生长影响的问题。

例如，通过增强膜和脂质体形成以平衡 MVA 途径中的碳通量；通过改变酿酒酵母中 TAG（三酰甘油）的脂肪酰基组成来调节脂质体大小以提高产量；利用某些酵母天然的隔离亲脂化合物的能力，通过调节 C/N 比率，平衡不同代谢途径的碳通量；利用细胞外输出策略，如通过双相萃取发酵和使用有机萃取剂，以减轻膜阻塞；过表达特定的转运蛋白（如 Pdr、Yol075 和 Snq2p）以促进输出疏水化学物质；通过化合物糖基化以提高稳定性和生物活性；通过基因工程修饰，结合上游通量增加、基因表达微调和限速基因拷贝数调整，以实现在微生物细胞中多葡聚糖的高产量从头合成。

第三类是代谢工程策略。该策略主要通过合理设计酶的共定位和表达，以有效解决内源性代谢竞争问题，实现目标化合物的高效生产。例如，在虾青素生产中，通过融合蛋白策略和酶的多重靶向显著提高了产量；在维生素 E 生产中，通过优化叶绿体衍生酶的表达和定位，提高了生育三烯醇的水平。

第四类是多级发酵策略。该策略主要通过调控基因表达和系统优化来解决细胞生长与产物合成之间冲突问题。例如，将细胞生长与产物合成解耦，以解决两者之间的冲突，实现高细胞密度和产物产量的平衡；构建温度响应系统，通过温度变化来调控基因表达，平衡细胞生长和产物合成；实施两阶段高密度发酵，通过在对数生长中后期降低温度，有效平衡细胞生长和有毒靶产物的积累，以提高产量；建立时空途径控制系统，解决双功能酶之间的竞争问题；开发双信号分层动态调控系统，实现多阶段调控。

第五类是形态工程策略。脂溶性酵母可以呈现出卵形酵母和丝状酵母两种形态，菌丝形态虽然提高了酵母对恶劣环境的抵抗力，但因其对介质粘度、流变性和质量/氧传递效率的不利影响，对工业生产过程有负面作用。

该策略包括环境控制、基因改造两个方面。环境控制是通过控制溶解氧、pH 和 C/N 比等环境因素，使脂质体细胞保持在酵母菌形态；基因改造则通过去除丝裂原激活蛋白激酶途径中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CLA4）和 cAMP 蛋白激酶 A 途径中的 C₂H₂ 型锌指转录因子（MHY1），完全消除菌丝生长。

综上所述，这篇综述指出了工程化微生物生产亲脂性抗氧化剂面临的挑战，展示了通过新兴技术来解决这些挑战并推动该领域发展的策略和方向，也为这些技术在其他产品或底盘生物中的广泛应用做出了展望。

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