华中农业大学张永安/涂加钢团队揭示SH3RF1介导的泛素化在乌鳢水泡病毒复制中的关键作用

乌鳢水泡病毒（Snakehead vesiculovirus, SHVV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）的单链负义 RNA 病毒，弹状病毒的 RNA 基因组编码五个蛋白：核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（L）。其中，P 蛋白是 RNA 聚合酶复合体的辅助因子，通过招募 N-RNA 模板形成核糖核蛋白复合体，进而进行 RNA 合成。

通过对SHVV感染的细胞进行4D无标记泛素组学分析，揭示了五种SHVV蛋白上的一系列泛素化位点（图1C）。作为病毒聚合酶L的辅助因子，P蛋白是一种高度磷酸化的多功能蛋白，但P蛋白是否以及如何泛素化仍然未知。因此，该研究重点研究了SHVV P的泛素化。

Fig. 1. Ubiquitome analysis of SHVV-infected CCO cells reveals ubiquitinated residues on SHVV proteins.

为了验证P蛋白是否确实发生了泛素化，研究人员在SHVV感染的CCO细胞中，使用抗泛素抗体进行Co-IP实验，结果显示P蛋白能够与抗泛素抗体共沉淀，这表明P蛋白在SHVV感染过程中确实发生了泛素化。此外，研究人员还在293T细胞中转染P蛋白和泛素蛋白的表达质粒，并通过标签抗体进行Co-IP实验，结果同样证实了P蛋白能够发生泛素化（图2） 。

Fig. 2. SHVV P is ubiquitinated.

为了明确SHVV P蛋白的泛素化类型，研究人员构建了一系列表达野生型泛素和单个赖氨酸残基突变为精氨酸（K到R）的泛素突变体的质粒。通过共免疫沉淀（Co-IP）实验，研究人员检测了P蛋白与这些泛素突变体的相互作用。结果显示，P蛋白与K33R和K48R突变体的共沉淀显著减少，而与K63R突变体几乎不发生共沉淀，这表明P蛋白主要通过K63连接方式发生泛素化。此外，研究人员还构建了只保留单个赖氨酸残基（K33、K48或K63）的泛素突变体，以进一步确认P蛋白的泛素化类型。实验结果表明，野生型泛素以及K33、K48和K63的泛素突变体都能够与P蛋白共沉淀，这进一步证实了P蛋白可以发生K33、K48和K63连接的泛素化，其中K63连接是主要的泛素化类型（图3）。

Fig. 3. SHVV P is ubiquitinated mainly via K63-linked ubiquitination.

为了精确识别P蛋白上的泛素化位点，研究人员构建了P蛋白的一系列点突变体，将单个赖氨酸残基（K170、K181、K264）突变为精氨酸（R），并进行了共免疫沉淀（Co-IP）实验。实验结果表明，与野生型P蛋白相比，K170R、K181R和K264R突变体与HA标记的泛素（HA-Ub）的共沉淀显著减少，其中K264R突变体几乎失去了与HA-Ub共沉淀的能力，这一发现指出K264是P蛋白发生泛素化的主要位点（图4）。

Fig. 4. SHVV P is ubiquitinated mainly at K264.

此外，研究人员还通过RNA干扰技术筛选了影响SHVV复制的E3泛素连接酶，发现MAEA、TRAF7和SH3RF1等E3泛素连接酶与P蛋白的泛素化密切相关，并通过共免疫沉淀实验验证了MAEA、TRAF7和SH3RF1与P蛋白的相互作用并介导其泛素化（图7、图8）。

Fig. 7. MAEA, TRAF7 , and SH3RF1 interact with SHVV P.

Fig. 8. MAEA, TRAF7 , and SH3RF1 promote the ubiquitination of SHVV P.

为了精确识别K63连接泛素化在P蛋白泛素化中的作用，研究人员使用K63连接泛素化质粒（pHA-Ub-K63）进行免疫共沉淀实验，结果表明TRAF7和SH3RF1能够介导P蛋白的K63连接泛素化，而MAEA则没有显著作用。通过构建P蛋白的K264R突变体（pMyc-P-K264R），并共转染E3泛素连接酶和K63连接泛素化质粒，研究人员发现SH3RF1能够显著促进野生型P蛋白的泛素化，但对K264R突变体的泛素化作用则显著降低。这表明SH3RF1主要通过介导P蛋白K264位点的K63连接泛素化来发挥作用。缺失环指结构域的SH3RF1突变体显著降低了P蛋白的泛素化水平，证实了环指结构域在SH3RF1介导的P蛋白泛素化中的核心作用。

Fig. 9. SH3RF1 mediates K63-linked ubiquitination of SHVV P at K264.

此外，研究人员还发现，过表达SH3RF1能够增强P蛋白的稳定性，并促进SHVV的复制。通过使用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）处理细胞，SH3RF1的过表达能够阻止P蛋白的降解，从而维持其稳定性。这一点对于SHVV的有效复制至关重要（图10）。

Fig. 10. SH3RF1 maintains the stability of SHVV P.

本研究深入探讨了乌鳢水泡病毒（SHVV）的P蛋白泛素化在病毒复制中的作用，发现E3泛素连接酶SH3RF1通过在P蛋白的K264位点介导K63连接泛素化，促进SHVV的复制。通过RNA干扰筛选和功能性实验，研究人员揭示了SH3RF1、MAEA和TRAF7等E3泛素连接酶与P蛋白的相互作用及其在泛素化中的作用。研究结果为理解SHVV的分子复制机制提供了新视角，并为开发新的抗病毒策略提供了潜在靶点。

华中农业大学涂加刚教授、张永安教授为本文的共同通讯作者，华中农业大学博士生覃向谋为本文第一作者，本研究获得中国国家自然科学基金（32173014、31972832和31930114）的支持。

来源：文献与实验

编辑：吃一口小猫