脑声问答（25）期丨啮齿动物刻板行为建模及评估方法

重复刻板行为是包括强迫症(obsessive compulsive disorder,OCD)在内众多精神疾病共同存在的一种临床症状。OCD病人主要表现为由焦虑、怀疑和对危险的过度敏感，导致侵入性、非必须的想法（obsessions）和重复性行为（compulsions）的产生。重复刻板行为是在动物和人类中均存在的一类常见的行为。在不同的物种中均可以观察到类似的行为，在不同的神经精神疾病中和个体不同的发育阶段中也可以观察到类似的行为。

重复刻板行为表现出如下三个方面的特征：第一，此类行为会高频率的重复发生；第二，行为主体追求行为或运动方式不变；第三，行为的表现或发生看起来是不恰当或令人感到奇怪的，并且会对患者生活会造成困扰。目前对于重复刻板行为的研究已经从基本的运动行为研究层面发展认知层面。啮齿类动物的自我理毛行为是一种复杂的先天行为，具有进化上保守的行为模式，也是啮齿类动物最常见的行为活动之一。自我理毛行为是一种内在行为，这种行为对动物自身的清洁和其他生理过程，例如体温调节、社会交流和唤醒等都有重要意义。在清醒的啮齿类动物中，自我理毛行为具有固定、顺序的模式。此外，自我理毛行为在不同物种之间非常相似。在啮齿类动物研究中,自我理毛行为可作为重复刻板行为评估的一个重要指标。

刻板行为与精神疾病

很多精神疾病动物模型中可以观察到异常的自我理毛行为，这也和不同类型精神疾病患者都出现异常的重复刻板行为的现象一致。但是需要注意，在不同精神疾病动物模型中自我理毛行为的表型却有所差别。啮齿类动物的自我理毛行为是一种衡量重复刻板行为的方法，而不是一种ASD病症特定模型。事实上，许多ASD小鼠品系还显示出与ASD相关的其他表型，例如显示出非理毛行为的其他重复刻板行为，或其他相关领域的缺陷，如社交障碍和焦虑等。抽动秽语综合征是另一种常见的、具有高度遗传性的神经精神障碍，主要的症状是抽动症状。

动物刻板行为特点

小鼠和大鼠的自我梳理显示出高度的行为复杂性和组织性。在发育的早期阶段，自我理毛行为仅包括面部梳理，但随着时间的推移，发展到对整个头部、颈部和躯干的梳理。成熟的啮齿类动物自我理毛行为由特定、高度刻板的顺序运动模式组成，称为链式模式。所谓的链式模式，是指行为的顺序是高度刻板的，一旦开始，它们就会在不需要外界感官反馈的情况下按顺序进行直至完成。一个典型的自我理毛链式行为通常包含以下四个阶段：第一阶段，双爪在鼻子附近进行一系列地椭圆形状的梳理（爪和鼻子的梳理）；第二阶段，包括一系列的单侧抚摸（每一次都由一只爪子完成），从触须到眼睛以下（脸部梳理）;第三阶段，包括一系列由两只爪子同时从头部向后和向上的双侧梳理（头部梳理）；第四阶段，主要包括对身体的舔舐。这样一个经典的链式自我理毛行为经常被嵌入到其他形式的梳理行为中，这些梳理行为分布到四个不同的、可预测的链式阶段，并且遵循相同的头-尾-体规则这种链式自我理毛行为约占所有观察到的啮齿动物自我理毛行为的10-15%，其余的行为遵循较难预测的顺序模式规则。

Fig1 动物刻板行为行为学表型

刻板行为评估方法

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自我理毛行为检测

将小鼠放进旷场（40cm×40cm×40.5cm）进行行为检测，并用CCD相机对行为进行记录。在每次实验开始之前，先让小鼠自由活动5分钟，适应环境。行为学测试完后，用10%酒精擦拭旷场装置，用吹风机充分吹干旷场后再开始下一次的测试，防止不同小鼠之间的气味对他们的行为产生影响。行为测试结束后，采用双盲原则对动物在测试不同阶段的自我理毛行为进行统计分析。

2

埋珠实验

埋珠实验测试大鼠的重复刻板行为。在标准鼠笼里放5cm厚的玉米芯垫料，铺平，将测试鼠放入其中适应5min，后垫料上放20个玻璃珠（直径10mm），按5×4规律分布，将老鼠放入笼中30min后取出，统计所埋玻璃珠的数量（被埋体积大于50%），将垫料铺平后重复利用。实验时将新鲜无味的垫料加入到崭新的饲养笼中(30cm×17cm×16cm)，深度为5cm，并将垫料压平压实；将标准玻璃弹珠(各种款式和颜色，直径约为2cm，重量约为5g)，按5排每排4弹珠等距离地轻放在垫料上；打开摄像头，记录30min内小鼠的运动情况。每次实验之间，更换鼠笼和垫料，并用温和的洗涤剂清洗弹珠，蒸馏水彻底冲洗，使用前晾干。梳理毛发作为反应重复刻板行为的指标广泛适用于孤独症小鼠模型中。常见的捋毛动作包括前肢梳理、摩擦清洗颜面、身体腹侧、尾部和生殖器清理。

Fig2 小鼠埋珠实验

通过旷场和高架零迷宫的实验分别检测动物的焦虑水平。

3

旷场实验

实验开始时，将重复刻板行为小鼠模型置于旷场一角并让小鼠的头朝向旷场中心区域，立刻通过视频记录其在旷场中自由活动的前5分钟内小鼠在旷场中心区域的时间。研究认为越是焦虑的小鼠在旷场边缘区域的活动时间越多，进入中心区域的活动时间越少，这是因为小鼠倾向于在空旷场地的边缘或角落活动，这样会使其感到安全，但是小鼠又有探索新空间的天性，所以也会进入旷场的中心区域进行探索，焦虑严重的小鼠为了安全则会很少进入中心区域进行探索。

4

高架零迷宫实验

在高架零迷宫实验中，将重复刻板行为小鼠模型置于高架零迷宫的某一开放臂和封闭臂的交界处，且将其头朝向封闭臂，让小鼠可以在迷宫中自由活动，通过视频记录和分析其在迷宫中前5分钟内在高架零迷宫开放臂活动的时间。研究认为越是焦虑的小鼠在高架零迷宫的封闭臂活动时间越多，进入开放臂的活动时间越少，这是因为小鼠在高台之上会感到害怕，因此进入封闭臂会使其感到安全，但是小鼠又有探索的天性，所以也会进入迷宫的开放臂进行探索，焦虑严重的小鼠为了安全则会很少进入开放臂进行探索。

评估参数

在刻板行为分析实验中，用摄像头记录30min内小鼠的行为，统计所观察到的各项刻板动作的次数、时间及其总次数(Nc)和时间(Tc)作为评估刻板运动的指标，统计的次数越多时间越长则表明重复刻板行为越严重。统计小鼠梳理毛发所用的时间(TG)占总时间的比例，比例越高则刻板重复行为越严重。在弹珠埋藏实验中，统计30min内小鼠埋藏弹珠的数目(埋藏深度为70%及以上，Nb)和小鼠挖掘垫料的时间(Td)，埋藏数目和挖掘时间增加则刻板重复行为越严重。

文献引用：

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7.Interrupted ongoing behaviour in two species of vole (Microtus agrestis and Clethrionomys britannicus). I. Response as a function of preceding activity and the context of an apparently "irrelevant" motor pattern.[J]. Fentress J C.Animal behaviour,1968(1)

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10.Prefrontal cortex and basal ganglia control access to working memory.. McNab Fiona;;Klingberg Torkel.Nature neuroscience.2008

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