淫羊藿苷和骨髓间充质干细胞的双网络丝素蛋白水凝胶用于骨修复

骨缺损通常由外伤、疾病（如骨肿瘤或骨质疏松）、以及先天性缺陷引起，严重骨缺损的治疗对传统方法如自体骨移植和同种异体骨移植提出了挑战。这些传统方法存在种种限制，如供骨来源有限、手术创伤大、可能的免疫排斥反应及疾病传播风险。基于天然蛋白水凝胶具有高水含量和良好的生物相容性，可以为细胞提供了一个支持生长和新组织形成的理想环境。尽管大部分蛋白质及其衍生物构建的用于骨缺损修复的水凝胶能够满足促进细胞生长的要求，然而这些水凝胶通常具有较差的机械性能，难以满足硬组织修复的要求。此外，骨组织再生还涉及成骨细胞和破骨细胞的动态平衡。为确保构建的水凝胶组织工程支架能够满足组织再生的需求，有效递送干细胞和其他生物活性分子以促进骨再生，也是当前研究的重点。

针对上述问题，暨南大学郭瑞课题组联合杭州医学院吴刚、林海燕主任团队，首先对环糊精和金刚烷进行改性，通过环糊精和金刚烷的主客体组装作用制备了三臂交联剂HGSM，再利用HGSM与甲基丙烯酰化丝素蛋白SFMA进行化学交联，形成双网络水凝胶HGSFMA，再利用水凝胶负载骨髓间充质干细胞（BMSCs）和淫羊藿苷（ICA）（图1）。该研究利用环糊精和金刚烷的主客体组装作用，显著增强了甲基丙烯酰化丝素蛋白（SFMA）的机械强度，并且利用该水凝胶递送骨髓间充质干细胞（BMSCs）和淫羊藿苷（ICA），抑制了破骨细胞的形成，促进损伤股骨的再生。该工作以“High-strength double-network silk fibroin based hydrogel loaded with Icariin and BMSCs to inhibit osteoclasts and promote osteogenic differentiation to enhance bone repair”为题发表在《Biomaterials Advances》（DOI：10.1016/j.bioadv.2024.213856）上。暨南大学郭瑞研究员、杭州医学院吴刚教授和林海燕教授为该文的通讯作者。

图1 水凝胶制备过程示意图

（1）HGSFMA水凝胶具有显著增强的模量和机械强度

制备的HGSFMA水凝胶相比于SFMA水凝胶，极大地提高了水凝胶的模量和压缩强度，模量的提升与HGSM的添加量成正比（图2）。

图2. SFMA和HGSFMA 水凝胶的化学结构和物理性质的表征。(A) HGSM的2D ROESY NMR谱；(B) SF和SFMA的1 H NMR谱；(C)水凝胶的SEM图像；(D)-(E)水凝胶流变检测；(F) 水凝胶的压缩应力-应变曲线；(G)水凝胶的溶胀率和（H）降解率；(I) ICA的体外累积释放速率曲线。

（2）水凝胶的生物相容性和体外成骨作用评价

进一步用BMSCs对ICA的毒性和水凝胶的细胞毒性进行评价，该研究制备的水凝胶无细胞毒性。并且HGSFMA/ICA水凝胶能够促进BMSCs的碱性磷酸酶ALP的表达（图3）。茜素红染色显示钙结节数量和成骨相关蛋白（RUNX2和OCN）的表达量也显著增加（图4）。

图3. SFMA和HGSFMA水凝胶对BMSCs的细胞毒性以及BMSCs体外诱导分化的ALP染色。（A）不同浓度ICA培养的BMSCs在光学显微镜下的形态学变化；（B）不同浓度ICA培养的BMSCs的细胞活力；（C）通过CCK-8测定与水凝胶共培养的 BMSC 的细胞活力；（D）水凝胶培养的BMSC的活/死染色和（E）细胞骨架染色图像；（F）水凝胶培养14天后BMSCs的ALP染色；（G）BMSCs的ALP活性的定量检测。

图4. 培养14天后BMSCs体外成骨评价。（A）茜素红染色；（B）RUNX2和OCN免疫荧光染色图像；（C）茜素红染色定量；（D）RUNX2和（E）OCN表达的定量分析。

（3）大鼠股骨损伤模型治疗效果评价

通过大鼠股骨损伤模型，验证水凝胶促进骨再生的作用。在股骨缺损治疗后1-2周，与HGSFMA组和对照组相比，HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC组表现出显着增强的骨再生，新形成的骨几乎填充了腔隙缺损。术后4周，HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC组显示出更大的新形成骨质量。Micro-CT数据的定量分析进一步支持了HGSFMA/ICA/BMSC组优异的骨再生潜力。该组的骨体积分数（BV/TV）/骨矿物质密度（BMD）显着高于其他对照组，骨小梁厚度（Tb/Th）增加和骨小梁分离（Tb. Sp）减少，证明了HGSFMA/ICA/BMSC水凝胶在促进大鼠股骨缺损模型中骨再生和改善骨质量方面的有效性（图5）。

图5 . CT成像评价大鼠股骨损伤的治疗效果。（A）再生骨组织的显微CT图像（白色虚线圆圈代表缺损位置）；（B）骨密度(BMD)定量指标；（C）骨体积分数定量指标(BV/TV)；（D）小梁数量定量指标(Tb.Th)；（E）骨小梁分离的定量指标 (Tb. Sp)。

维持成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡对于有效的骨修复至关重要。破骨细胞的持续存在和升高会显着阻碍骨再生的速度。炎症是驱动破骨细胞分化的关键因素。ICA已被证明可以有效抑制炎症细胞因子的释放并调节NF-κB信号通路的激活，进而减轻局部炎症并抑制破骨细胞分化。此外，淫羊藿苷通过STAT3途径促进下游成骨基因骨钙素（OCN）的转录，其中STAT3直接与OCN启动子相互作用。TRAP染色显示HGSFMA/ICA和HGSFMA/ICA/BMSC组内破骨细胞数量显著降低（图6）。图6 治疗4周后破骨细胞的染色。白色箭头指示破骨细胞

研究结论：

该研究报道了双网络交联高强度水凝胶HGSFMA对比SFMA具有明显提升的机械强度，并且具有优异的生物相容性，可以作为载体递送药物和干细胞，是一种良好的骨组织工程支架材料。体外研究结果表明，HGSFMA/ICA水凝胶具有增强BMSC增殖和分化的能力。大鼠股骨损伤修复模型治疗效果评价中，通过micro-CT、病理染色、TRAP染色、关键成骨标志物的免疫荧光染色等证实了HGSFMA/ICA/BMSC在抑制破骨细胞和促进成骨细胞分化中的有效性。总体来说，该研究结果对于启发改善天然蛋白机械性能，构建基于天然蛋白的骨组织工程支架具有积极意义。

https://www-sciencedirect-com.lille.sjlib.cn/science/article/pii/S2772950824000992