JACS：荧光化学探针用于受损细胞膜的免洗成像

导读

近日，德国慕尼黑大学Oliver Thorn-Seshold教授在荧光化学探针的设计合成及受损细胞膜的成像方面取得新进展，相关研究成果以“Fluorogenic Chemical Probes for Wash-free Imaging of Cell Membrane Damage in Ferroptosis, Necrosis, and Axon Injury”为题发表在Journal of the American Chemical Society上。本文报道了一种可以显示受损细胞中整个细胞质体积的高分辨率免洗荧光探针。其中，含二磺酸盐的探针只能特异性地进入膜受损的细胞中，然后被酶激活并对其进行标记。此外，作者通过对酯酶探针MDG1进行处理后可得到不易水解的探针MDG2并实现了多色细胞成像。最后，作者证明了MDG探针可用于检测受损的轴突细胞膜、区分活体中的受损细胞。MDG探针的设计合成为细胞膜免洗成像技术的发展提供了强有力的模块化工具，同时能够对疾病中膜损伤细胞的选择性诊断与治疗带来启发。文章链接DOI: 10.1021/jacs.3c07662.

正文

细胞膜也称质膜，是分隔细胞质与细胞周围环境的一层膜结构。磷脂双分子层是构成细胞膜的基本骨架。在水环境中，磷脂分子的疏水尾部相互聚集，亲水头部则朝向外侧形成双分子层结构。一些生理生化过程如压力、机械性损伤和化学变化等会引起细胞膜损伤。虽然膜损伤会导致细胞死亡，但这并非是一个不可逆过程。一般来讲，通常带有电荷的基团如磺酸盐等会降低分子的透膜性。带电荷的成像探针通常会被用于检测细胞膜的完整性以区分细胞的生存状态。比如，Trypan Blue是一种四磺化阴离子亲水染料，不易通过细胞膜，可用来判断细胞的健康状态。Propidium iodide（PI）是一种非渗透膜的红色荧光染料。PI不能通过活细胞膜但可以穿透受损细胞，因此通常用于鉴定细胞的活力并常被用于荧光显微镜和流式细胞仪当中（Figure 1a）。因此，发展可以检测细胞膜完整性的小分子探针对于修复受损细胞至关重要。本文中，作者发展了检测膜损伤的荧光探针（Figure 1b），该探针能够实现1）低背景荧光、免洗和免减影成像；2）区分细胞膜损伤细胞；3）受损细胞膜的特异性成像和4）高亮度的窄谱带多色荧光成像。该探针的设计思路对于研究如何将药物选择性地运送到受损细胞中并对其进行诊断与治疗具有重要意义。 化学加——科学家创业合伙人，欢迎下载化学加APP关注。

Figure1.非渗透型细胞探针

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者合成了新型含磺酸盐的分子H2-FS1，该分子的激发和发射波长分别位于500 nm和525 nm。基于此，作者又设计合成了荧光探针i2-FS1和a2-FS1（Figure 2a）。在共聚焦成像实验中，探针i2-FS1，a2-FS1和H2-FS1由于其含有磺酸盐基团而被细胞“排斥”，展现出较强的细胞外荧光信号（Figure 2b-c）。相比之下，含有酯基的i2-FS0和i2-FS1在细胞内的荧光强度相当。当荧光分子的基团被双重O-酰化后，修饰一个磺酸盐基团不足以被细胞排斥。a2-FS1的细胞外荧光强度低于i2-FS1，说明异丁酸的亲脂性促进了分子被细胞吞噬。流式细胞实验中的单峰数据也再次证明了以上观点（Figure 2d）。

Figure2.不同种类探针染色健康细胞的荧光图像

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了调节分子对膜的透过性，作者合成了第二代含酯基探针（Figure 3a），最终分别得到了含有甲基（iMe-FS1），氨基（iEM-FS1）和磺酸盐基团（iPS-FS2）的分子（Figure 3a-b）。其中，含双磺酸盐基团的分子iPS-FS2由于极性基团的存在而被细胞排斥，几乎没有细胞内荧光信号（Figure 3c，d）。作者通过诱导膜损伤以研究探针在受损细胞中的摄取和激活行为，共聚焦成像结果表明所有磺酸化的探针具有更高的细胞内荧光信号，但只有iPS-FS2最适合用于对受损细胞的免洗成像（Figure 3e-h）。

Figure3.探针染色受损细胞的荧光图像

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

在膜损伤的轴突组织模型中，MDG1探针被健康的细胞所“排斥”，但是却能够对AAPH-受损细胞进行选择性染色（Figure 4a，b）。因此，基于膜电荷的差异，二磺酸化结构的酯酶探针MDG1可以高灵敏度地检测膜损伤。在进入细胞后，MDG2比MDG1更具有水解稳定性，更能有效地被硫醇“分解”，在受损细胞具有很高的荧光强度。因此，MDG系列探针为区分受损细胞提供了合成简单、性质灵活可调的小分子平台（Figure 4c-e）。

Figure4. 探针对受损细胞的细胞膜成像

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

铁死亡的主要机制是在二价铁或酯氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化，从而诱导细胞死亡。BODIPY是一种用于铁死亡研究的常用分子（Figure 5f）。非氧化-还原依赖性的MDG1探针可以直接反映膜的完整程度。作者利用T细胞研究了MDG1能否用于铁死亡过程的成像。流式细胞数据表现出明显的增强（Figure 5a-e），与BODIPY-C11指示的过氧化程度相符（Figure 5f-k）。

Figure 5. 探针检测铁死亡过程中的膜损伤

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者用AAPH试剂破坏轴突组织后进行成像，Propidium iodide（PI）并不能区分受损的轴突（Figure 6a），但MDG1能够选择性地示踪受损轴突（Figure 6b），正常组织未发现有荧光信号（Figure 6c）。在果蝇胚胎的活体模型染色成像中，一般能够观察到DNA靶向的SYTOX57或者PI等非细胞渗透型染料的积累（Figure 6d）。同时，作者对比了细胞核靶向染料SYTOX Green和MDG1对受损胚胎的成像效果（Figure 6e-f），MDG1被证实具有良好的光学稳定性和靶向性。

Figure6.探针检测活体内轴突和坏死组织中的膜损伤

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

德国慕尼黑大学Oliver Thorn-Seshold教授团队通过在分子设计中利用电荷和极性基团的巧妙结合发展了用于细胞膜成像的探针“分子平台”。开发了模块化荧光探针，显示受损细胞的整个细胞质体积，具有接近零的背景荧光，因此不需要洗涤。相比于传统受损细胞的成像染料，该MDG系列探针可以实现对受损细胞的细胞膜的高分辨率免洗荧光成像，并可以无损追踪和量化一些生理变化过程中细胞膜的通透性。随着化学、生物学和医学学科的不断发展，细胞膜荧光探针的应用范围越来越广泛，对于了解细胞的生命活动和疾病的发生发展具有重要意义。

文献详情：

Fluorogenic Chemical Probes for Wash-free Imaging of Cell Membrane Damage in Ferroptosis, Necrosis, and Axon Injury

Philipp Mauker, Daniela Beckmann, Annabel Kitowski, Constanze Heise, Chantal Wientjens, Andrew J. Davidson, Simone Wanderoy, Gabin Fabre, Angelika B. Harbauer, Will Wood, Christoph Wilhelm, Julia Thorn-Seshold, Thomas Misgeld, Martin Kerschensteiner, and Oliver Thorn-Seshold*

J. Am. Chem. Soc.2024
https://doi.org/10.1021/jacs.3c07662

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