Cell | 基于表观遗传“编辑”操纵Prime Editing效率的新方法

Prime editing（先导编辑，PE）是新一代基于CRISPR的精准基因编辑工具【1,2】。它具有高可编程和特异性，在基础研究以及临床治疗中有广泛运用。然而，相较于前几代基因编辑方法（比如：Cas9和base editing），PE的效率仍然很低，而且不同编辑位点有很大差异。目前，调控PE效率的因素主要有四个，它们分别是1）prime editor 复合体的表达量和稳定性；2）编辑位点和突变的序列；3）trans-acting factors，比如DNA修复蛋白；4）编辑位点的染色质和表观遗传环境。此前，影响PE的前三个因素已被深入研究，与之相关的新方法被证明可以有效提高编辑效率【3-11】。然而，表观遗传对于PE的影响还没有被破解。

2024年4月11日，华盛顿大学, HHMIJay Shendure团队在Cell杂志上发表了题为Chromatin context-dependent regulation and epigenetic manipulation of prime editing的研究。该研究通过建立新的分子生物学方法，阐述了影响PE效率的表观遗传因子，并且开发出基于表观遗传“编辑”从而有效操纵PE效率的新方法。

首先，为了探究PE在不同染色质环境的工作效率，作者建立了一个T7-assisted reporter mapping assay，这个方法可以高效地定位所有随机插入基因组的PE reporter （synHEK3） 。通过比较4000多个位点的编辑效率，作者发现PE效率与H3K79me2正相关，而且可以被表观遗传特性有效预测。通过深入分析，发现转录延伸是高效PE的决定因素。

其次，为了研究chromatin context-dependent regulation，即表观遗传环境 （cis-chromatin environment） 和反式作用因子的相互作用，作者开发了一种基于单细胞测序 (sci-RNA-seq3)【12,13】的技术。通过将该技术运用在PE和pooled genetic screen中，作者可以将细胞受到的遗传干扰和不同染色质环境中的PE响应联系起来，进而发现chromatin context-dependent regulator – HLTF。

最后，作者试图利用操纵编辑位点周围的表观遗传环境来改变编辑效率。通过CRISPRoff【14】降低编辑基因的转录，PE效率能够被显著降低，证明了PE编辑效率和转录的紧密联系。反之，通过CRISPR activation对编辑基因启动子的预激活，PE效率可以被大幅提升。例如，对于基因CREB3L3，一个效率仅为5%的epegRNA在激活基因表达后，可以被提升到66% （16.5x） 。作者还证明了此方法对多种细胞环境 （K562，iPSCs） ，所有突变类型都有很好的提升效果。

此工作建立了一系列新的、可以用来研究chromatin context-dependent regulation的分子生物学方法。当运用在基因编辑中，作者发现了调控PE效率的重要因子。这些方法对研究其他chromatin-associated processes都会有广泛意义。

该文章的通讯作者为Jay Shendure。该文章的第一作者以及共同通讯作者为华盛顿大学博士后李晓弈。

参考文献

1. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149–157 (2019).

2. Chen, P. J. & Liu, D. R. Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation. Nat. Rev. Genet. 24, 161–177 (2023).

3. Chen, P. J. et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell 184, 5635-5652.e29 (2021).

4. Nelson, J. W. et al. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nat. Biotechnol. (2021) doi:10.1038/s41587-021-01039-7.

5. Yan, J. et al. Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein. Nature (2024) doi:10.1038/s41586-024-07259-6.

6. Kim, H. K. et al. Predicting the efficiency of prime editing guide RNAs in human cells. Nat. Biotechnol. 39, 198–206 (2021).

7. Mathis, N. et al. Predicting prime editing efficiency and product purity by deep learning. Nat. Biotechnol. (2023) doi:10.1038/s41587-022-01613-7.

8. Koeppel, J. et al. Prediction of prime editing insertion efficiencies using sequence features and DNA repair determinants. Nat. Biotechnol. (2023) doi:10.1038/s41587-023-01678-y.

9. Yu, G. et al. Prediction of efficiencies for diverse prime editing systems in multiple cell types. Cell 186, 2256-2272.e23 (2023).

10. Mathis, N. et al. Predicting prime editing efficiency across diverse edit types and chromatin contexts with machine learning. bioRxiv 2023.10.09.561414 (2023) doi:10.1101/2023.10.09.561414.

11. Ferreira da Silva, J. et al. Prime editing efficiency and fidelity are enhanced in the absence of mismatch repair. Nat. Commun. 13, 760 (2022).

12. Cao, J. et al. The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature 566, 496–502 (2019).

13. Martin, B. K. et al. Optimized single-nucleus transcriptional profiling by combinatorial indexing. Nat. Protoc. (2022) doi:10.1038/s41596-022-00752-0.

14. Nuñez, J. K. et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell 184, 2503-2519.e17 (2021).

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00311-8