中药小类1区: 多组学揭示独一味总多酚苷提取物改善肝纤维化

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导读

在肝纤维化消退过程中，肝星状细胞（ HSC）的减少可能通过活化的HSC（aHSC）凋亡或失活而发生。 一种新的抗纤维化治疗方法包括将肝肌成纤维细胞转化为静止状态。独一味（ L.rotata ）是一种口服藏药，传统上用于治疗皮肤病、黄疸和风湿病。在我们之前的研究中，我们发现 L.rotata 的总多酚糖苷提取物（TPLR）促进aHSC的凋亡， 可 用于治疗肝纤维化。 然而， TPLR是否诱导aHSC成为失活HSC（iHSC）尚不清楚，其潜在机制在很大程度上仍不 明确 。 本研究旨在检测 TPLR在肝纤维化消退过程中对肝星状细胞表型的影响，并探讨其潜在的作用机制。 使用免疫荧光（ IF）染色、逆转录聚合酶链式反应（RT–PCR）和蛋白质印迹来评估TPLR对肝星状细胞（HSC）表型的影响。 采用转录组学和蛋白质组学方法来鉴定所涉及的主要信号通路。基于组学结果，通过 TGF-β1激活LX-2 细胞 中的过表达和敲除实验，证实了TPLR对aHSC表型的可能机制。 使用 CCl 4 诱导的肝纤维化小鼠模型，我们评估了TPLR的抗肝纤维化作用，并根据组学研究结果探讨了其潜在机制。 发现 TPLR通过显著降低α-SMA和Desmin的蛋白表达来诱导aHSC分化为iHSC。转录组学和蛋白质组学分析表明，AGE/RAGE信号通路在TPLR 处理 后HSC的形态转化中起着至关重要的作用。 使用 RAGE过表达和敲除的体外实验表明，TPLR影响HSC表型的机制与RAGE/RAS/MAPK/NF-κB轴密切相关。 在肝纤维化模型中， TPLR通过下调RAGE及其下游靶点，明显抑制AGEs的产生，减轻肝组织损伤和纤维化。AGE/RAGE轴在TPLR 处理 后活化的肝星状细胞（aHSC）转化为失活的肝星形细胞（iHSC）中起关键作用， 表明 TPLR作为肝纤维化治疗剂的潜力。

图文摘要

论文ID

原名：Transcriptomic and proteomic investigation of the ameliorative effect of total polyphenolic glycoside extract on hepatic fibrosis in Lamiophlomis rotata Kudo via the AGE/RAGE pathway

译名：转录组学和蛋白质组学研究揭示独一味总多酚苷提取物通过AGE/RAGE通路改善肝纤维化

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2024.1

通讯作者：潘正

通讯作者单位：重庆医科大学

实验设计

实验结果

1. TPLR诱导活化HSC转化为iHSCS

在毒素诱导的肝纤维化恢复过程中，aHSC或肌成纤维细胞的命运已被揭示。大约50%的肌成纤维细胞逃避细胞凋亡，并在纤维化消退时作为不活跃的HSC留在肝脏中。失活HSC的存活与转录因子ETS1、GATA4、FOX-1、IRF2和PPARγ的上调以及AP1、CTCF、TEAD1、MEF2和NF-κB的下调有关。为了研究TPLR对HSC表型的影响，我们使用TGF-β激活LX-2细胞，随后用TPLR处理（图1A）。药理学和遗传学研究表明，α-SMA是活化HSC的特征标志物之一，其表达的desmin比qHSC和肝脏中的其他非实质细胞更多。我们证明，在用TGF-β处理的细胞中，α-SMA和desmin都被显著诱导，而这些蛋白质的表达在用TPLR处理后显著降低（图1B）。同样，蛋白质印迹分析显示，TGF-β处理后，α-SMA和desmin的蛋白质表达显著增加。尽管如此，在TPLR处理后，这些蛋白质的表达显著降低（图1C–E）。此外，qPCR证实，相应基因的转录水平与用TPLR孵育后观察到的蛋白质表达趋势一致（图1F–G）。随后，相关性分析显示，在TGF-β和TPLR刺激的条件下，α-SMA和Desmin的表达呈正相关（图1H）。此外，我们检测了ETS1、GATA4、FOX-1、IRF2、PPARγ、AP1、CTCF、TEAD1、MEF2和NF-κB转录因子的表达，这些转录因子在TGF-β和TPLR处理后调节星形胶质细胞的形态。TGF-β抑制ETS1、GATA4、FOX-1、IRF2和PPARγ的转录。这些分子的转录水平可以通过TPLR上调。相反，TGF-β诱导AP1、CTCF、TEAD1、MEF2和NF-κB的转录，并且这些分子的转录可以被TPLR下调（图1I）。所有结果表明，TPLR诱导aHSCS转化为iHSCs，从而抑制TGF-β诱导的LX-2细胞激活 。

图1 TPLR诱导活化的HSC转化为iHSC。A、TGF-β诱导的qHSC转化为aHSC和TPLR处理的程序表。B、 α-SMA和desmin的IF染色。C-E、α-SMA和desmin表达的蛋白质印迹分析。F，G、 α-SMA和desmin转录物的qPCR分析。H、α-SMA与desmin表达的相关性分析。I、 qPCR用于检测调节星形胶质细胞形态的转录因子。相对于对照组的统计学显著性，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；相对于TGF-β组，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，n = 3。

2.转录组学和蛋白质组学显示AGE/RAGE信号通路在TPLR处理后的HSC表型中至关重要

为了研究TPLR诱导aHSC转化为iHSC的机制，使用RNA测序和蛋白质组学测定进行综合分析。首先进行RNA-seq分析以鉴定差异表达的基因，随后使用堆叠图和维恩图对这些结果进行可视化。图2A和B表明 TPLR处理后的LX-2细胞中分别有449和815个DEG。在这些基因中，对照组和模型组有197个（61%）上调，124个（39%）下调。随后，对前10种不同的信号通路进行了KEGG通路分析，包括TNF、IL-17、AGE、TGFβ信号通路、NOD样受体、细胞因子-细胞因子受体和ECM受体相互作用（图2C）。已知这些信号通路参与对各种损伤的免疫反应，并作为损伤相关分子模式（DAMP）发挥作用。第三，在用TPLR处理后，GSEA显示与损伤和肝纤维化的DAMP反应密切相关的IL-6/JAK/STAT3信号传导、炎症反应、上皮-间充质转化途径和TGFβ信号传导途径相关的基因表达减少（图2D–G）。

图2 与TPLR处理后HSC表型相关的DEG的转录组学和蛋白质组学分析。A、根据转录组学分析，饼图显示了TPLR处理后或未经TPLR处理的HSC基因数量的显著变化。B、火山图描绘了用TPLR或对照处理后与HSC表型相关的DEP。C、KEGG富集分析。前10个途径显著富集。蓝线图显示基因数量随时间变化显著。D-G、GSEA分析显示，TPLR降低了IL-6/JAK/STAT3信号传导、炎症反应、上皮-间质转化和TGFβ信号传导途径。H、蛋白质组学分析显示TPLR处理后或未经TPLR处理的HSC基因数量显著变化的饼图。I、火山图显示了TPLR治疗组和对照组之间的DEP。J、TPLR和对照组之间的DEP热图（红色，上调；蓝色，下调）。K、对DEPs进行注释，将其分为三类，包括BP、CC和MF。L、气泡图显示KEGG途径富集分析，上述途径均显著富集，颜色由蓝色逐渐变为红色，表明P值逐渐降低。圆圈的大小意味着映射的蛋白质的数量。。

我们还进行了蛋白质组学测定以评估TPLR处理后的差异蛋白。共鉴定出50种和86种差异表达蛋白，其中对照组和治疗组分别有16种（16%）下调和35种（47%）上调（图2H–I）。使用热图和GO注释对这些蛋白质进行可视化。数十个基因被HSC中诱导的TGF-β上调，而被TPLR处理下调（图2J）。已鉴定的差异表达蛋白参与BPs，包括细胞过程、生物调节、代谢过程和发育过程的正调控（图2K）。CC分析显示，差异表达的蛋白质主要参与细胞解剖实体和含蛋白质复合物。在MF类别中，差异表达的蛋白质与结合和催化活性有关。最后，结合转录组数据，蛋白质组数据的KEGG通路分析显示，糖尿病并发症患者的AGE/RAGE信号通路发生了显著改变（图2L）。简而言之，组学结果表明，AGE/RAGE信号通路在TPLR处理的HSC的形态学翻译中起着关键作用。

3. TPLR体外通过AGE/RAGE途径诱导aHSC转化为iHSC

RAGE最初被确定为AGEs的受体，由高血糖诱导并在糖尿病中积聚。早期的研究主要集中在RAGE与糖尿病的关系上。RAGE可以与多种配体结合，启动多种信号通路，包括PI3K/AKT/MAPK和JAK/STAT通路。这些信号级联激活各种转录因子，如NF-κB、AP-1和STAT3，促进促炎基因的表达以及细胞过程，包括迁移、增殖和凋亡（图3A）。为了研究TPLR是否通过AGE/RAGE途径促进aHSC向iHSC的翻译，我们用在aHSC中过表达或敲低RAGE的重组慢病毒处理LX-2 细胞。免疫荧光染色显示TPLR抑制RAGE的表达。过表达RAGE后，与TPLR组相比，RAGE和desmin的表达分别增加了2倍和1.7倍。相反，RAGE敲低进一步降低了RAGE和desmin的表达。与TPLR处理组相比，RAGE敲低组的RAGE和desmin表达分别低3/7和2/7（图3B–D）。随后，通过蛋白质印迹评估RAGE和下游蛋白的表达。TPLR降低了RAGE、RAS、p-P38、P105和P65的表达，而RAGE过表达的慢病毒诱导了它们的表达（图3E-J）。

图3 TPLR通过AGE/RAGE途径诱导aHSC转化为iHSC。A、HSC激活中AGE/RAGE通路的程序表。B、RAGE和desmin的IF染色。C-D，HSC中RAGE和desmin水平的定量。E-J，RAGE和下游蛋白表达的蛋白质印迹分析。K、 qPCR检测转录因子的表达。与TGF-β组相比具有统计学意义，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n = 3。与TPLR组相关，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，n = 3。

4. TPLR减轻CCl4小鼠肝损伤的实验研究

为了确定TPLR对肝损伤的影响，我们使用CCl4构建了肝纤维化小鼠模型（图4A）。为了评估TPLR预防肝损伤和纤维化的疗效，我们将其与两种阳性对照药物秋水仙碱（P1）和FZHY制剂（P2）进行了比较。苏木精和伊红（H&E）、Masson和Sirius红染色用于检查不同TPLR剂量下的肝脏病理。结果表明，模型组肝细胞受损，结构紊乱，肝细胞样结节再生，组织中形成假小叶。肝窦、中央静脉和门静脉周围可见炎症细胞浸润。Masson染色显示CCl4组中存在显著的胶原沉积和严重的纤维化（图4B）。然而，用TPLR处理后，这些病变显著减轻，如受损肝细胞、假小叶和胶原数量减少所示（图4B）。此外，对TPLR、FZHY和秋水仙碱对肝损伤的影响的评估显示，秋水仙碱，其次是高剂量TPLR和FZHY胶囊，在消除肝纤维化方面表现出显著的疗效。此外，TPLR显著降低了ALT、AST和总胆红素（TBIL）的血液水平，这是肝功能的关键指标（图4C–E）。此外，TPLR显著降低了血液中TNFα和IL-6的水平，同时诱导了IL-10的表达，这是炎症的关键指标（图4F–H）。总之，这些结果表明，TPLR抑制了炎症因子的释放，并保护小鼠免受CCl4诱导的肝损伤。。

图5 TPLR减轻CCl4小鼠模型的肝损伤。A、用于构建CCl4小鼠模型的策略。B、肝切片的苏木精-伊红染色、Masson染色和天狼星红染色。C-E、血清ALT、AST和TBIL水平。F–H、血清TNFα、IL-6和IL-10水平。相对于NC组的统计学显著性，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；相对于模型组，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，n = 5。NC：正常组；模型：CCl4诱导肝纤维化组；P1：秋水仙碱治疗组；P2：FZHY胶囊治疗组；L：TPLR 0.05 g/kg治疗组；M：TPLR 0.1 g/kg治疗组；H：TPLR 0.2 g/kg治疗组。

5. TPLR减轻CCl4小鼠模型中的肝纤维化

在使用CCl4诱导小鼠肝纤维化的实验中，IF染色结果显示，CCl4组纤维化隔膜中α-SMA和desmin高表达。相反，TPLR和阳性对照组的α-SMA和desmin水平均下降，表明其在预防肝损伤方面的疗效。此外，秋水仙碱给药显著减轻了肝纤维化（见图5A-D）。同样，免疫印迹和qPCR分析表明，与对照组相比，处理组的α-SMA表达显著增加。然而，TPLR和阳性对照组的mRNA和蛋白质表达水平明显低于CCl4组（见图5E–I）。总之，这些发现为TPLR抑制CCl4诱导的aHSC的肝纤维化提供了证据。

图5 TPLR减轻CCl4小鼠模型的肝纤维化。A、IF染色分析CCL4小鼠肝脏中α-SMA和desmin的表达。B–C，通过IF染色定量相关的α-SMA和desmin表达。D、 α-SMA与desmin表达的相关性分析。E-G、蛋白质印迹分析α-SMA和desmin的表达。H–I，qPCR检测α-SMA和desmin mRNA转录物。相对于NC组的统计学显著性，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；相对于模型组，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，n = 5。NC：正常组；模型：CCl4诱导肝纤维化组；P1：秋水仙碱治疗组；P2：FZHY胶囊治疗组；L：TPLR 0.05 g/kg治疗组；M：TPLR 0.1 g/kg治疗组；H：TPLR 0.2 g/kg治疗组。

6. TPLR通过AGE/RAGE信号通路减轻CCl4小鼠模型中的纤维化

为了进一步研究TPLR在CCl4小鼠模型中减轻肝纤维化的潜在机制，对AGE/RAGE信号通路进行了研究。CCl4诱导的肝纤维化模型的免疫荧光分析显示，与对照组相比，模型组的α-SMA和RAGE表达显著增加。然而，TPLR处理显著降低了这些蛋白质的表达（参见图6A）。ELISA显示TPLR治疗后AGEs的产生显著减少（见图S1）。此外，蛋白质印迹分析显示，与对照组相比，CCl4组中RAS、p-P38、P105和P65的蛋白质表达水平升高，这些是AGE/RAGE信号通路的下游靶点。然而，与CCl4组相比，在TPLR组和阳性对照组（FZHY制剂）中，RAS、p-P38、P105和P65的mRNA表达水平均下调（见图6B-G）。总之，我们的研究结果表明，在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，TPLR通过AGE/RAGE信号通路显著减轻肝纤维化的形成。

图6 TPLR通过抑制AGE/RAGE信号通路减轻CCl4小鼠模型的纤维化。A，IF染色分析RAGE和desmin在CCl4小鼠肝脏中的表达。B-G，蛋白质印迹分析RAGE和下游蛋白质的表达。相对于NC组的统计学显著性，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；相对于模型组，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001，n = 5。NC：正常组；模型：CCl4诱导肝纤维化组；P1：秋水仙碱治疗组；P2：FZHY胶囊治疗组；L：TPLR 0.05 g/kg治疗组；M：TPLR 0.1 g/kg治疗组；H：TPLR 0.2 g/kg治疗组。

7.UPLC-Q/TOF/MS法测定TPLR的化学成分

采用MS和MSn负离子模式对独一味总多酚苷提取物进行了分析。为了鉴定这些化合物，使用PubChem和SciFinder数据库搜索先前报道的L.rotata和其他野芝麻属物种的类黄酮和多酚苷的光谱数据。TPLR中的主要化合物，包括9种苯丙素、3种黄酮类化合物和2种多酚类化合物（如图7和表1所示），是根据早期研究中这些化合物的保留时间和质量分布进行鉴定的。

表1 通过UPLC-Q/TOF-MSn鉴定了TPLR中的主要化合物

图7 负离子模式下TPLR的UPLC-QTOF/MSn色谱图。用UPLC-Q精密质谱仪测定旋 L. rotata 苯丙素提取物的总负离子流图 。MS全扫描是在100–1000 Da范围内以模式采集的 ，扫描时间为1 s、毛细管电压设置为2500 V和锥体电压为40 V。

肝纤维化是与慢性肝损伤相关的纤维性瘢痕的形成，由细胞外基质（ECM）蛋白的积累引起，这些蛋白主要是交联的I型和III型胶原，它们取代受损的正常组织成为瘢痕。设计用于抑制和逆转肝纤维化发展每个阶段的病理变化的治疗剂旨在在损伤的根本原因停止后诱导肌成纤维细胞凋亡或失活。我们之前的研究表明，在200 μg/mL的TPLR可显著诱导HSC凋亡。然而，肝脏的微环境具有异质结构，在药物分布到疤痕组织方面提出了挑战。然而，TPLR是否影响肝脏的异质性结构及其可能的潜在机制在很大程度上仍然未知。

aHSC转化为iHSC具有改善和预防肝纤维化的潜力。在这项研究中，我们发现50 μg/mL剂量的TPLR可诱导aHSC向iHSC转化。为了更好地了解TPLR的潜在作用机制，我们对100 μg/mL剂量的TPLR处理后TGF-β诱导的HSC进行了转录组学和蛋白质组学分析 。根据转录组学分析， KEGG分析揭示AGE/RAGE轴是前6个途径之一，而TNF、IL-17途径、细胞因子-细胞因子受体和ECM受体相互作用是前5个途径。随后的GSEA证明，TPLR处理导致AGE/RAGE轴下游信号通路，即IL-6/JAK/STAT3信号通路和炎症反应的减少。此外，蛋白质组学数据的KEGG通路分析显示AGE/RAGE轴减少，这是TPLR影响第三大的信号通路。考虑到转录组学和蛋白质组学的研究结果，很明显，在TGF-β诱导的LX-2细胞中，TPLR处理后，AGE/RAGE信号通路发生了显著变化 ，这意味着该轴在HSC形态的翻译中起着关键作用。

AGEs和RAGE轴的激活在包括肺、肾、心血管系统和肝脏在内的各种器官的纤维化进展中至关重要，并与非酒精性脂肪肝（NASH）、肝纤维化、肝硬化和癌症有关。此外，在不激活AGEs的情况下，RAGE还结合广泛的配体，包括S1004、S1006A和HMGB1，并作为影响肝纤维化进展中免疫炎症反应的几个下游信号级联的重要介质。在肝组织中，RAGE主要在肝星状细胞（HSC）的膜表面表达，有证据表明，RAGE的上调与HSC转化为肌成纤维细胞（aHSC）有关，后者驱动肝纤维化并导致炎症和癌症。随着RAGE在TGF-β刺激的HSC中的过度表达和敲除，我们的实验证实了RAGE/RAS/MAPK/NF-κB轴在通过TPLR处理的aHSC向iHSC的进展中起着关键作用。

为了进一步验证TPLR是否通过AGE/RAGE轴减轻纤维化，使用秋水仙碱和FZHY胶囊作为阳性对照，在CCl 4 诱导的模型中评估TPLR对肝纤维化的影响。我们评估了TPLR、FZHY和秋水仙碱减轻小鼠肝损伤和肝纤维化的能力，发现秋水仙碱对减轻肝纤维化的作用最大，其次是大剂量TPLR和FZHY胶囊。结果证实，TPLR显著降低AGEs的产生，并下调RAS、p-P38、P105和P65的比例和mRNA表达。总之，我们的研究结果表明，TPLR通过RAGE/RAS/MAPK/NF-κB轴改善肝纤维化。

体外实验表明，TPLR明显抑制AGEs的形成（图S2）。AGEs的制备通常包括将BSA与甲基乙二醛孵育8天甚至12天。在我们的研究中，TGF-β刺激LX-2 细胞24  h，其在短时间内在没有甲基乙二醛的情况下产生很少的AGE。体内实验证实，在CCl 4 诱导的肝纤维化小鼠模型中，TPLR明显抑制AGEs的产生。此外，最近的研究发现，TPLR中的两种主要苯丙素类成分Verbascoside和Forsythoside B（分别如图7中的化合物5和8所示）显著抑制RAGE和p-P38的表达，并可能在调节肝星状细胞的状态变化中发挥重要作用。因此，所有这些结果表明，TPLR诱导的aHSC转化为iHSC，从而通过AGE/RAGE轴减轻纤维化。

全长人RAGE由结构域组成，包括细胞外结构域、疏水性跨膜结构域和细胞质结构域。RAGE的细胞外结构可细分为V、C1和C2结构域。X射线晶体学、NMR光谱以及体外和体内实验等研究表明，VC1亚结构域含有带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基。另一方面，天然存在的苯乙醇和类黄酮苷，也称为多酚苷，通常由带负电的酚酸单元组成。这些化合物很容易与RAGE的VC1结构域相互作用。在提取物中，苯乙醇和黄酮苷被鉴定为主要化合物。然而，由于实验的局限性，需要进一步的研究来确定这些化合物中的哪一种负责抑制AGE/RAGE轴。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874124000205/

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